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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教基因载体跑琼脂糖凝胶电泳的结果无条带问题
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xixi61887

金虫 (小有名气)

[求助] 请教基因载体跑琼脂糖凝胶电泳的结果无条带问题

各位虫友，我做的是聚合物/DNA的纳米粒子凝胶电泳。聚合物/DNA溶液含1微克DNA，总体积为80微升。上样时取10微升溶液，与2微升loading buffer混合。电压100V，跑30min。EB 0.5微克/ml 染色1h，脱色0.5h。问题出现了，由于凝胶成像仪坏了，我用实验室254nm的普通紫外分析仪照了一下，什么东西都没有！
（我做的东西不需要将条带分开，每个孔对应一个带即可，我是通过带的位置判断带正电聚合物能不能跟负电DNA完全结合，如果不能完全结合，会往阳极移动，否则会留在上样孔内。）
我从小木虫以前的帖子中查找了一下，可能的原因：1、DNA上样量少。我计算了一下，每孔中加入的液体总DNA含量约100ng，有帖子说1-10ngDNA都能分析出来，不知道我加的量是不是太少？2、波长问题。我查到的可以用254nm紫外光，是实验室普通仪器太简陋还是别的原因？3、由于本人新手，可能上样时移液器枪头扎破了样品槽底部，但15个槽不可能都破，跑的时候我侧面观察有1-2个样品槽可能漏了，但大部分槽是好的。4、不存在DNA跑出胶的情况，但脱色时由于仪器故障脱色了4个h，拿出来以后胶上面没有上样buffer的蓝色痕迹（刚跑完会有两种蓝色的痕迹），这是说明我染色时间过长所以EB染色不好吗？这会导致最终看不出条带吗？5、凝胶成像仪器坏了有没有较好的替代方案？254nm紫外灯是不是根本不可行？

我是生物实验新手，遇到这种问题很着急，如果有了解原因或者做过相关实验的虫友，请不吝赐教！谢谢
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1楼2013-04-15 10:40:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
你跑marker了吗？EB后染一般30分钟足够，不用脱色直接观测。脱色可以降低背景。直接观测没有成像仪灵敏，一般需要上样量较大才看得清楚，很可能是你的上样量少了。不知道你的DNA条带应该多大，EB染色的亮度也和分子大小相关。我觉得应该可以用紫外灯照。
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2楼2013-04-16 07:03:02
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xixi61887

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-16 07:03:02
你跑marker了吗？EB后染一般30分钟足够，不用脱色直接观测。脱色可以降低背景。直接观测没有成像仪灵敏，一般需要上样量较大才看得清楚，很可能是你的上样量少了。不知道你的DNA条带应该多大，EB染色的亮度也和分子 ...

谢谢您的回答！我不需要跑marker，对照组是裸DNA，样品组是聚合物DNA纳米粒子。染色及脱色步骤是师兄毕业论文中的。我把放了3天的胶找其他凝胶仪器照了一下，有条带出现，是365nm，所以可能254nm紫外不可用。不知道您用琼脂糖时每孔加入多少质量的DNA？谢谢！
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3楼2013-04-16 11:18:04
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xixi61887 at 2013-04-16 11:18:04
谢谢您的回答！我不需要跑marker，对照组是裸DNA，样品组是聚合物DNA纳米粒子。染色及脱色步骤是师兄毕业论文中的。我把放了3天的胶找其他凝胶仪器照了一下，有条带出现，是365nm，所以可能254nm紫外不可用。不知道 ...

上样量要看目标分子量大小。一般几kb的上100ng左右，几十kb的上1μg左右。
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4楼2013-04-16 13:07:58
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xixi61887

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-16 13:07:58
上样量要看目标分子量大小。一般几kb的上100ng左右，几十kb的上1μg左右。...

您好！我用的是大约5千个碱基对的DNA，每孔上100ng，又做了一次，脱色完立马照相，条带都有，但不是很亮，而且有的上样孔处的DNA亮度特别低，基本都看不清，请问您了解这种现象的原因吗？是脱色及染色时，DNA溶在水中流失了吗？谢谢！
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5楼2013-04-17 21:27:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
内容已删除
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6楼2013-04-18 00:30:12
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xixi61887

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-18 00:30:12
问一下为什么上样孔处会亮呢？一般点样孔应该不亮，只有目标条带发亮才对。脱色一般不会造成DNA流失。对于DNA这样的大分子扩散是很慢的，不会轻易从胶中溶出来。后染法不影响DNA的迁移率，如果你不是很在乎这个，可 ...

您好！DNA与正电聚合物结合后，如果聚合物比例高，会留在孔内，所以孔内也会发光。我希望它留在孔内并发亮，但是实际做的时候用的8齿的梳子，不知道是不是孔太大了，照的时候看不出来？谢谢！
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7楼2013-04-18 17:14:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xixi61887 at 2013-04-18 17:14:52
您好！DNA与正电聚合物结合后，如果聚合物比例高，会留在孔内，所以孔内也会发光。我希望它留在孔内并发亮，但是实际做的时候用的8齿的梳子，不知道是不是孔太大了，照的时候看不出来？谢谢！...

明白了。所以你用后染，不希望EB的电性影响迁移吧。不过，我觉得你可以尝试直接在胶里加EB。
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8楼2013-04-19 00:50:44
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xixi61887

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-19 00:50:44
明白了。所以你用后染，不希望EB的电性影响迁移吧。不过，我觉得你可以尝试直接在胶里加EB。...

谢谢！我再尝试一下。
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9楼2013-04-19 14:18:40
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bambooliang

新虫 (初入文坛)
请问楼主，我也是一名电泳新手，做的也是聚合物/DNA的纳米粒子凝胶电泳，遇到与楼主相似的问题，我的是裸DNA有带，最高比例在上样孔有强烈荧光，但是低中比例什么都没有，楼主你的问题我想已经解决了吧，能指教一下吗？
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10楼2015-06-16 10:18:46
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