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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR没有出现内参基因的条带和目的条带，请问是什么原因？
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR没有出现内参基因的条带和目的条带，请问是什么原因？

最近在做RT-PCR，两步法的。结果RNA的质量还是可以，三条带明显，5s比较浅，但是没有目的条带和内参的基因的出现，pcr用的是Taq酶，扩增的片段是350bp，280bp，360bp，三种基因条带，结果没有出现任何带，用1.8%琼脂糖凝胶电泳。我想向大家请教一下是不是用的Taq酶保真性不高所致？还是模板质量还是不高？还是用琼脂糖电泳跑小片段不合适，用聚丙烯酰胺比较合适呢？？？
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1楼2012-08-09 19:56:11
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wtyyyyy1988

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
内参都没有，就要考虑是否是试剂出了问题！
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我就是我
2楼2012-08-09 20:48:45
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wtyyyyy1988 at 2012-08-09 20:48:45
内参都没有，就要考虑是否是试剂出了问题！

谢谢！您说的试剂主要是指哪种试剂呢？？？
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3楼2012-08-10 09:58:00
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-10 13:54:07
你的PCR产物跟琼脂糖浓度无关，不论哪个浓度，至少应该有带或许带是SMEAR不是非常SHARP. 原因1，反转录过程出了问题，2，PCR组分出了问题。
如果是1，请重新做反转录。如果是2，请把所有PCR组分全部换成新的。
建议您，先把PCR所有组分换成新的之后看结果再确定。如果换了全新的组分仍然扩增不出来，就只有重新做反转录。因为你的内参也没扩增出来，排除引物的问题。
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4楼2012-08-10 12:25:42
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linqin1029

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-08-10 13:54:18
建议：
1.先确定RNA在反转录的时候是否成功。
2.可能模板浓度太高，建议稀释10~50倍后，取1ul进行PCR，在电泳检测。
3.你给的三个片段，用2%的琼脂糖胶是完全可以跑电泳得。
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5楼2012-08-10 12:54:07
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-10 12:25:42
你的PCR产物跟琼脂糖浓度无关，不论哪个浓度，至少应该有带或许带是SMEAR不是非常SHARP. 原因1，反转录过程出了问题，2，PCR组分出了问题。
如果是1，请重新做反转录。如果是2，请把所有PCR组分全部换成新的。
建 ...

恩，非常感谢您的解答！！我也是想把pcr的一些组分重新换一下！谢谢您了！
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6楼2012-08-11 13:00:10
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by linqin1029 at 2012-08-10 12:54:07
建议：
1.先确定RNA在反转录的时候是否成功。
2.可能模板浓度太高，建议稀释10~50倍后，取1ul进行PCR，在电泳检测。
3.你给的三个片段，用2%的琼脂糖胶是完全可以跑电泳得。

您好，您说的“先确定RNA在反转录的时候是否成功”中，怎么样来确定反转录是成功的？还是进行电泳吗？
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7楼2012-08-11 13:01:22
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dongyanqutao

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

您好，我的实验中也出现了这种情况，请问你是怎么解决的，还有你问的怎样确定反转录的问题有答案了吗，希望你能帮我分析一下，谢谢了
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8楼2013-01-27 16:15:47
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by dongyanqutao at 2013-01-27 16:15:47
您好，我的实验中也出现了这种情况，请问你是怎么解决的，还有你问的怎样确定反转录的问题有答案了吗，希望你能帮我分析一下，谢谢了

我是从以下几个方面做起。
1. 从基础做起，把蓝，黄，百枪头，EP管等实验器材彻底处理，保证枪头里面充满DEPC水，这样可以将枪头彻底处理，保证没有RNA酶；操作时候要在干净地方，带手套和口罩。RNA提取的纯度和完整性是最重要的。
2.我更换了RNA提取试剂，换成了TaKaRa的RNA提取试剂，一开始用的是国产的，但觉得不怎么样。逆转录酶用Promega的M-MLV逆转录酶。按照说明操做。
3.RT成功与否是用内参引物做PCR，看看能不能扩增出内参来验证。扩增出，表明成功，否则，不成功。
4.PCR后跑胶用的上样缓冲液最好是购买的，我们买的是TaKaRa的6X loading buffer。不要用自己配制的。这个也挺重要的。
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9楼2013-01-27 16:52:07
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wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

除了楼上提到的一些原因，我再补充一个，会不会是引物的问题，引物讲解断裂之类的
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风雪夜归人
10楼2013-01-28 13:00:48
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