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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR没有出现内参基因的条带和目的条带，请问是什么原因？
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR没有出现内参基因的条带和目的条带，请问是什么原因？

最近在做RT-PCR，两步法的。结果RNA的质量还是可以，三条带明显，5s比较浅，但是没有目的条带和内参的基因的出现，pcr用的是Taq酶，扩增的片段是350bp，280bp，360bp，三种基因条带，结果没有出现任何带，用1.8%琼脂糖凝胶电泳。我想向大家请教一下是不是用的Taq酶保真性不高所致？还是模板质量还是不高？还是用琼脂糖电泳跑小片段不合适，用聚丙烯酰胺比较合适呢？？？
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1楼 2012-08-09 19:56:11
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by linqin1029 at 2012-08-10 12:54:07
建议：
1.先确定RNA在反转录的时候是否成功。
2.可能模板浓度太高，建议稀释10~50倍后，取1ul进行PCR，在电泳检测。
3.你给的三个片段，用2%的琼脂糖胶是完全可以跑电泳得。

您好，您说的“先确定RNA在反转录的时候是否成功”中，怎么样来确定反转录是成功的？还是进行电泳吗？
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7楼2012-08-11 13:01:22
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wtyyyyy1988

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
内参都没有，就要考虑是否是试剂出了问题！
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我就是我
2楼2012-08-09 20:48:45
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wtyyyyy1988 at 2012-08-09 20:48:45
内参都没有，就要考虑是否是试剂出了问题！

谢谢！您说的试剂主要是指哪种试剂呢？？？
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3楼2012-08-10 09:58:00
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-10 13:54:07
你的PCR产物跟琼脂糖浓度无关，不论哪个浓度，至少应该有带或许带是SMEAR不是非常SHARP. 原因1，反转录过程出了问题，2，PCR组分出了问题。
如果是1，请重新做反转录。如果是2，请把所有PCR组分全部换成新的。
建议您，先把PCR所有组分换成新的之后看结果再确定。如果换了全新的组分仍然扩增不出来，就只有重新做反转录。因为你的内参也没扩增出来，排除引物的问题。
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4楼2012-08-10 12:25:42
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