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RT-PCR没有出现内参基因的条带和目的条带，请问是什么原因？
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| 最近在做RT-PCR，两步法的。结果RNA的质量还是可以，三条带明显，5s比较浅，但是没有目的条带和内参的基因的出现，pcr用的是Taq酶，扩增的片段是350bp，280bp，360bp，三种基因条带，结果没有出现任何带，用1.8%琼脂糖凝胶电泳。我想向大家请教一下是不是用的Taq酶保真性不高所致？还是模板质量还是不高？还是用琼脂糖电泳跑小片段不合适，用聚丙烯酰胺比较合适呢？？？ |
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wtyyyyy1988
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8楼2013-01-27 16:15:47
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我是从以下几个方面做起。 1. 从基础做起，把蓝，黄，百枪头，EP管等实验器材彻底处理，保证枪头里面充满DEPC水，这样可以将枪头彻底处理，保证没有RNA酶；操作时候要在干净地方，带手套和口罩。RNA提取的纯度和完整性是最重要的。 2.我更换了RNA提取试剂，换成了TaKaRa的RNA提取试剂，一开始用的是国产的，但觉得不怎么样。逆转录酶用Promega的M-MLV逆转录酶。按照说明操做。 3.RT成功与否是用内参引物做PCR，看看能不能扩增出内参来验证。扩增出，表明成功，否则，不成功。 4.PCR后跑胶用的上样缓冲液最好是购买的，我们买的是TaKaRa的6X loading buffer。不要用自己配制的。这个也挺重要的。 |
9楼2013-01-27 16:52:07
wqj1988926
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10楼2013-01-28 13:00:48
