应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR没有出现内参基因的条带和目的条带，请问是什么原因？
121/2返回列表12下一页
查看: 4681  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR没有出现内参基因的条带和目的条带，请问是什么原因？

最近在做RT-PCR，两步法的。结果RNA的质量还是可以，三条带明显，5s比较浅，但是没有目的条带和内参的基因的出现，pcr用的是Taq酶，扩增的片段是350bp，280bp，360bp，三种基因条带，结果没有出现任何带，用1.8%琼脂糖凝胶电泳。我想向大家请教一下是不是用的Taq酶保真性不高所致？还是模板质量还是不高？还是用琼脂糖电泳跑小片段不合适，用聚丙烯酰胺比较合适呢？？？
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

PCR问题集锦

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-08-09 19:56:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wtyyyyy1988

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
内参都没有，就要考虑是否是试剂出了问题！
赞一下 回复此楼
我就是我
2楼2012-08-09 20:48:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wtyyyyy1988 at 2012-08-09 20:48:45
内参都没有，就要考虑是否是试剂出了问题！

谢谢！您说的试剂主要是指哪种试剂呢？？？
赞一下 回复此楼
3楼2012-08-10 09:58:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-10 13:54:07
你的PCR产物跟琼脂糖浓度无关，不论哪个浓度，至少应该有带或许带是SMEAR不是非常SHARP. 原因1，反转录过程出了问题，2，PCR组分出了问题。
如果是1，请重新做反转录。如果是2，请把所有PCR组分全部换成新的。
建议您，先把PCR所有组分换成新的之后看结果再确定。如果换了全新的组分仍然扩增不出来，就只有重新做反转录。因为你的内参也没扩增出来，排除引物的问题。
赞一下 回复此楼
4楼2012-08-10 12:25:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linqin1029

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-08-10 13:54:18
建议：
1.先确定RNA在反转录的时候是否成功。
2.可能模板浓度太高，建议稀释10~50倍后，取1ul进行PCR，在电泳检测。
3.你给的三个片段，用2%的琼脂糖胶是完全可以跑电泳得。
赞一下 回复此楼
5楼2012-08-10 12:54:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-10 12:25:42
你的PCR产物跟琼脂糖浓度无关，不论哪个浓度，至少应该有带或许带是SMEAR不是非常SHARP. 原因1，反转录过程出了问题，2，PCR组分出了问题。
如果是1，请重新做反转录。如果是2，请把所有PCR组分全部换成新的。
建 ...

恩，非常感谢您的解答！！我也是想把pcr的一些组分重新换一下！谢谢您了！
赞一下 回复此楼
6楼2012-08-11 13:00:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by linqin1029 at 2012-08-10 12:54:07
建议：
1.先确定RNA在反转录的时候是否成功。
2.可能模板浓度太高，建议稀释10~50倍后，取1ul进行PCR，在电泳检测。
3.你给的三个片段，用2%的琼脂糖胶是完全可以跑电泳得。

您好，您说的“先确定RNA在反转录的时候是否成功”中，怎么样来确定反转录是成功的？还是进行电泳吗？
赞一下 回复此楼
7楼2012-08-11 13:01:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dongyanqutao

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

您好，我的实验中也出现了这种情况，请问你是怎么解决的，还有你问的怎样确定反转录的问题有答案了吗，希望你能帮我分析一下，谢谢了
赞一下 回复此楼
8楼2013-01-27 16:15:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by dongyanqutao at 2013-01-27 16:15:47
您好，我的实验中也出现了这种情况，请问你是怎么解决的，还有你问的怎样确定反转录的问题有答案了吗，希望你能帮我分析一下，谢谢了

我是从以下几个方面做起。
1. 从基础做起，把蓝，黄，百枪头，EP管等实验器材彻底处理，保证枪头里面充满DEPC水，这样可以将枪头彻底处理，保证没有RNA酶；操作时候要在干净地方，带手套和口罩。RNA提取的纯度和完整性是最重要的。
2.我更换了RNA提取试剂，换成了TaKaRa的RNA提取试剂，一开始用的是国产的，但觉得不怎么样。逆转录酶用Promega的M-MLV逆转录酶。按照说明操做。
3.RT成功与否是用内参引物做PCR，看看能不能扩增出内参来验证。扩增出，表明成功，否则，不成功。
4.PCR后跑胶用的上样缓冲液最好是购买的，我们买的是TaKaRa的6X loading buffer。不要用自己配制的。这个也挺重要的。
赞一下 回复此楼
9楼2013-01-27 16:52:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

除了楼上提到的一些原因，我再补充一个，会不会是引物的问题，引物讲解断裂之类的
赞一下 回复此楼
风雪夜归人
10楼2013-01-28 13:00:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 czcpudai 的主题更新
121/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 5/250 2026-08-29 09:49 by G6APbkg8SA6w
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-29 09:38 by G6APbkg8SA6w
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 5/250 2026-08-29 09:28 by G6APbkg8SA6w
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +8 苏东坡二世 2026-08-23 8/400 2026-08-28 14:41 by lkforward
[基金申请] 基金不中，共勉 +11 eulota 2026-08-26 11/550 2026-08-28 14:22 by 火星超人xi
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +5 zhaosm1982 2026-08-27 6/300 2026-08-27 16:00 by lfy8008
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +7 process2012 2026-08-23 10/500 2026-08-26 19:23 by hmhminy
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭