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czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR没有出现内参基因的条带和目的条带,请问是什么原因?

最近在做RT-PCR,两步法的。结果RNA的质量还是可以,三条带明显,5s比较浅,但是没有目的条带和内参的基因的出现,pcr用的是Taq酶,扩增的片段是350bp,280bp,360bp,三种基因条带,结果没有出现任何带,用1.8%琼脂糖凝胶电泳。我想向大家请教一下是不是用的Taq酶保真性不高所致?还是模板质量还是不高?还是用琼脂糖电泳跑小片段不合适,用聚丙烯酰胺比较合适呢???
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-10 13:54:07
你的PCR产物跟琼脂糖浓度无关,不论哪个浓度,至少应该有带或许带是SMEAR不是非常SHARP. 原因1,反转录过程出了问题,2,PCR组分出了问题。
如果是1,请重新做反转录。如果是2,请把所有PCR组分全部换成新的。
建议您,先把PCR所有组分换成新的之后看结果再确定。如果换了全新的组分仍然扩增不出来,就只有重新做反转录。因为你的内参也没扩增出来,排除引物的问题。
4楼2012-08-10 12:25:42
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wtyyyyy1988

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
内参都没有,就要考虑是否是试剂出了问题!
我就是我
2楼2012-08-09 20:48:45
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wtyyyyy1988 at 2012-08-09 20:48:45
内参都没有,就要考虑是否是试剂出了问题!

谢谢!您说的试剂主要是指哪种试剂呢???
3楼2012-08-10 09:58:00
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linqin1029

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-08-10 13:54:18
建议:
1.先确定RNA在反转录的时候是否成功。
2.可能模板浓度太高,建议稀释10~50倍后,取1ul进行PCR,在电泳检测。
3.你给的三个片段,用2%的琼脂糖胶是完全可以跑电泳得。
5楼2012-08-10 12:54:07
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