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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

[求助] 融合PCR请帮忙看看图片吧 已有2人参与

我两个条带 一个是1680bp;另一个是2550bp ,然后融合,第二轮PCR不加引物,其他同常规PCR;用的是LAtaq酶。融合之后既有融合片段,又有原始的两条片段!可是当我进行完第三轮pcr之后(此时加入的引物为2550bp上游引物 和 1680bp的下游引物),跑胶发现第二轮pcr跑胶图片中原始条带2550bp不怎么亮的带,第三轮却是出奇的亮啊!而融合片段却不怎么亮,求解啊?(1KBmarker 和 Hind111)融合PCR请帮忙看看图片吧
第二轮pcr图片
融合PCR请帮忙看看图片吧-1
第三轮PCR图片

[ Last edited by jiaoxiayoulu on 2014-3-5 at 17:14 ]
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 三蛰 at 2014-03-05 20:16:20
Gibson?

????
6楼2014-03-05 20:29:03
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
jiaoxiayoulu(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-03-31 01:10:11
第二轮PCR不加引物,其他同常规PCR,此时循环数设为7-8,然后加引物,扩增。
如需大量扩增,以第二轮的作为模板(1ul),进行扩增。可稍微提高下退火温度。
2楼2014-03-05 17:14:50
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-05 17:14:50
第二轮PCR不加引物,其他同常规PCR,此时循环数设为7-8,然后加引物,扩增。
如需大量扩增,以第二轮的作为模板(1ul),进行扩增。可稍微提高下退火温度。

我第一轮没用高保真酶,用的普通taq酶!第二轮我设置了20个循环,目的是让他尽可能多的产生融合片段!第三轮PCR时我以第二轮产物(没做胶回收,也没有纯化)为模板,左边条带为取了10ul二轮产物,右边条带我是取了5ul二轮产物为模板。我想知道,为什么二轮PCR小条带很亮,而三轮PCR大条带却很亮???????
3楼2014-03-05 18:08:25
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
jiaoxiayoulu(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-03-31 01:10:23
你这两次加的样量一样吗?再一个你把两次结果放一块跑跑。再一个你第三次PCR模板不要加太多,我们一般稀释一百倍再跑。
hehe
7楼2014-03-05 21:01:26
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