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tu475575025新虫 (小有名气)
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重叠PCR比想象中的诡异p几十轮了始终没有拿到大片段 已有5人参与
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本人做三个片段A（1000bp---B(2200bp)--C(900bp)的融合pcr，先常规分别回收A、B、C，同源臂19-20bp,重叠之前都是模板互为引物先跑10个循环，再以这些pcr产物为模板进行重叠pcr。 诡异的是，重叠AB可得到单一的目的片段，重叠BC也可以得到单一的目的片段，ABC一起重或者以AB、BC为模板依然无法得到ABC。难道不能重叠4k以上的片段？盼同仁点化中~~~~~~~~~~~~~~ |
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tu475575025(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2014-03-29 21:16:16
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你可以单独得到AB或者BC，说明你片段中的重叠部分长度啊，退火温度等还是没有问题的，比较可能的问题是模板的比例。 “ABC一起重或者以AB、BC为模板依然无法得到ABC” 如果是A,B,C重叠，你需要测量(OD260)或者跑胶定一下A,B,C的浓度，然后保证在重叠PCR的时候，三者的摩尔比为1:1:1。 如果是AB,BC重叠，也需要计算摩尔比例。注意，由于你ABC三个片段的长度有差异，计算摩尔浓度的时候要按不同的长度计算分子量。 此外，重叠PCR的时候，引物的浓度一定要低，使用普通引物浓度的1/10，会有助于你的重叠产物的扩增。 另外，如果你实在是重叠不出来，还可以选择B方案。 看你的图谱，你应该是选择了SmaI + BamHI连接ABC拼接片段进入载体，之所以拼接ABC是为了去除ABC片段中的BamHI/SmaI的酶切位点，如果是这样的话，你可以不通过拼接，将ABC片段连入载体。 首先，载体SmaI + BamHI双酶切，然后Klenow补平 之后，重新设计引物，直接PCR从A到C的片段，平末端连接进入载体。 你需要注意两个问题，平末端连接会有反向的可能，需要测序验证。 为了保证读码框的正确，你在设计引物的时候需要考虑酶切片段补平后序列，以BamHI为例 5‘-GGATCC-3’ 3‘-CCTAGG-3’ 你需要看一下载体的序列，弄清楚酶切后载体还剩什么序列，如果酶切后载体为： 5‘-G 3’-CCTAG 补平后为： 5‘-GGATC 3'-CCTAG 为了保证读码框的正确性，你需要在设计引物的时候在引物5’或3'端（这个要根据你的情况，看BamHI在5‘还是3’引物）加个G（5‘）/C（3’）使得补平后依然是BamHI的酶切位点。 |
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tu47557502513楼2014-03-28 18:35:58
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3楼2014-03-27 10:23:25
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2楼2014-03-27 09:43:59
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这确实是个办法，是这么个情况：载体上可用位点很少，插入片段中间有一些克隆位点，所以这些位点不能用，我首先将一个片段F连到载体上，另外一共有5个片段要连到一起再与载体连接，因为载体上和片段上能用的酶切位点只有两个，我就设计了D的上游加了一个载体上的位点，E的下游加一个中间酶切位点，DE重叠，然后就是A上游加与E相同的中间酶切位点，ABC重叠，C下游加载体上另一个酶切位点，最后将DE、ABC酶切后与载体连接形成 载体-DE-中间酶切位点-ABC-F-载体(如图) 最后的载体差不多20k了，现在就是卡在ABC重不上了，还不知道这个方案是否能打通。 我用的是takara 的GXL高保真酶，也是可以扩30k的一个酶。NEB的phusion成功率高吗，想请教一下，你们用这个酶重过多大的？  MAP.jpg  MAP1.jpg |
4楼2014-03-27 11:45:45
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