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tu475575025

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 爱上文慧 at 2014-03-27 14:54:49
我现在的问题是,我pcr电泳条带大小正确,PCR产物测序也没有问题,但是连接T载后做菌p一直没有目的条带,很奇怪,是不是重叠PCR产物不稳定啊,还是运气太差?

你用空T载作对照,看看重组T载有没有滞后,有滞后说明有外源片段连上去了,但你还是p不到的话,可能就是你连T载PCR时片段污染了其它片段了哟
11楼2014-03-27 15:11:02
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tu475575025

新虫 (小有名气)

再散金~~~~大家多多讨论,本人如果解决了这个诡异的问题,立即与大家分享。不知道有人用过天根的专门做多重PCR的试剂盒(多重PCR扩增试剂盒(KT109))没有?另外有专门为重叠PCR开发的试剂盒吗?
12楼2014-03-27 15:23:31
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woolley

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
tu475575025(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2014-03-29 21:16:16
tu475575025: 金币+15, 有帮助, 谢谢你的建议 2014-04-05 19:09:42
你可以单独得到AB或者BC,说明你片段中的重叠部分长度啊,退火温度等还是没有问题的,比较可能的问题是模板的比例。
“ABC一起重或者以AB、BC为模板依然无法得到ABC”
如果是A,B,C重叠,你需要测量(OD260)或者跑胶定一下A,B,C的浓度,然后保证在重叠PCR的时候,三者的摩尔比为1:1:1。
如果是AB,BC重叠,也需要计算摩尔比例。注意,由于你ABC三个片段的长度有差异,计算摩尔浓度的时候要按不同的长度计算分子量。
此外,重叠PCR的时候,引物的浓度一定要低,使用普通引物浓度的1/10,会有助于你的重叠产物的扩增。

另外,如果你实在是重叠不出来,还可以选择B方案。
看你的图谱,你应该是选择了SmaI + BamHI连接ABC拼接片段进入载体,之所以拼接ABC是为了去除ABC片段中的BamHI/SmaI的酶切位点,如果是这样的话,你可以不通过拼接,将ABC片段连入载体。
首先,载体SmaI + BamHI双酶切,然后Klenow补平
之后,重新设计引物,直接PCR从A到C的片段,平末端连接进入载体。
你需要注意两个问题,平末端连接会有反向的可能,需要测序验证。
为了保证读码框的正确,你在设计引物的时候需要考虑酶切片段补平后序列,以BamHI为例
5‘-GGATCC-3’
3‘-CCTAGG-3’
你需要看一下载体的序列,弄清楚酶切后载体还剩什么序列,如果酶切后载体为:
5‘-G
3’-CCTAG
补平后为:
5‘-GGATC
3'-CCTAG
为了保证读码框的正确性,你需要在设计引物的时候在引物5’或3'端(这个要根据你的情况,看BamHI在5‘还是3’引物)加个G(5‘)/C(3’)使得补平后依然是BamHI的酶切位点。

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13楼2014-03-28 18:35:58
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
tu475575025(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励交流 2014-03-29 21:16:51
tu475575025: 金币+3, 谢谢建议 2014-04-05 19:11:12
你PCR时模板浓度不要太高,尽量保证模板1:1加入。
hehe
14楼2014-03-28 21:25:18
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tu475575025

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by woolley at 2014-03-28 18:35:58
你可以单独得到AB或者BC,说明你片段中的重叠部分长度啊,退火温度等还是没有问题的,比较可能的问题是模板的比例。
“ABC一起重或者以AB、BC为模板依然无法得到ABC”
如果是A,B,C重叠,你需要测量(OD260)或者跑胶 ...

意见很中肯,我的A、B、C不在同一个模板上,不能直接扩增ABC,所以我打算优化一下PCR体系再试试,另外用模板互为引物p时时退火温度是不是应该低点比较好,而且浓度高些,比如以高浓度的AB、BC互为引物,理论上应该得到相同摩尔量的ABC吧。
15楼2014-03-29 13:00:19
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by d00614028 at 2014-03-27 14:07:56
曾经用NEB的phusion做过4K  4K相加得8K的,也做过3K与200bp相加的,所以我觉得还是比较好的,我没有用过其他的酶。...

您好!我想问一下,我最近在做overlap-pcr,连接的两个片段是3.1kb和4.7kb,用过NEB的Q5和全式金的fast-pfu酶,都没有overlap上,我想问一下,您是如何将两个4kb片段连接成8kb的?除了酶换成Phusion外,其他组分浓度时怎么样的?盼复!谢谢!
16楼2014-11-11 09:51:49
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nirui466

禁虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

17楼2015-05-14 20:46:25
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小王叨叨

新虫 (初入文坛)

不知道楼主做的如何了?问题是怎么解决的呢?我现在也在做三个片段的融合 也是要不没有条带 要不就是弥散条带,有一次大小对了 然后用融合的片段再P就P不出来了 不知道什么问题啊?求指导
18楼2015-12-08 13:19:04
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