应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重叠PCR比想象中的诡异p几十轮了始终没有拿到大片段
182/2返回列表上一页12
查看: 2950  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

tu475575025

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 爱上文慧 at 2014-03-27 14:54:49
我现在的问题是，我pcr电泳条带大小正确，PCR产物测序也没有问题，但是连接T载后做菌p一直没有目的条带，很奇怪，是不是重叠PCR产物不稳定啊，还是运气太差？

你用空T载作对照，看看重组T载有没有滞后，有滞后说明有外源片段连上去了，但你还是p不到的话，可能就是你连T载PCR时片段污染了其它片段了哟
赞一下 回复此楼
11楼2014-03-27 15:11:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tu475575025

新虫 (小有名气)
再散金~~~~大家多多讨论，本人如果解决了这个诡异的问题，立即与大家分享。不知道有人用过天根的专门做多重PCR的试剂盒（多重PCR扩增试剂盒(KT109)）没有？另外有专门为重叠PCR开发的试剂盒吗？
赞一下 回复此楼
12楼2014-03-27 15:23:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

woolley

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tu475575025(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2014-03-29 21:16:16
tu475575025: 金币+15, ★有帮助, 谢谢你的建议 2014-04-05 19:09:42
你可以单独得到AB或者BC，说明你片段中的重叠部分长度啊，退火温度等还是没有问题的，比较可能的问题是模板的比例。
“ABC一起重或者以AB、BC为模板依然无法得到ABC”
如果是A,B,C重叠，你需要测量(OD260)或者跑胶定一下A,B,C的浓度，然后保证在重叠PCR的时候，三者的摩尔比为1:1:1。
如果是AB,BC重叠，也需要计算摩尔比例。注意，由于你ABC三个片段的长度有差异，计算摩尔浓度的时候要按不同的长度计算分子量。
此外，重叠PCR的时候，引物的浓度一定要低，使用普通引物浓度的1/10，会有助于你的重叠产物的扩增。

另外，如果你实在是重叠不出来，还可以选择B方案。
看你的图谱，你应该是选择了SmaI + BamHI连接ABC拼接片段进入载体，之所以拼接ABC是为了去除ABC片段中的BamHI/SmaI的酶切位点，如果是这样的话，你可以不通过拼接，将ABC片段连入载体。
首先，载体SmaI + BamHI双酶切，然后Klenow补平
之后，重新设计引物，直接PCR从A到C的片段，平末端连接进入载体。
你需要注意两个问题，平末端连接会有反向的可能，需要测序验证。
为了保证读码框的正确，你在设计引物的时候需要考虑酶切片段补平后序列，以BamHI为例
5‘-GGATCC-3’
3‘-CCTAGG-3’
你需要看一下载体的序列，弄清楚酶切后载体还剩什么序列，如果酶切后载体为：
5‘-G
3’-CCTAG
补平后为：
5‘-GGATC
3'-CCTAG
为了保证读码框的正确性，你需要在设计引物的时候在引物5’或3'端（这个要根据你的情况，看BamHI在5‘还是3’引物）加个G（5‘）/C（3’）使得补平后依然是BamHI的酶切位点。
赞一下(3人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

tu475575025
13楼2014-03-28 18:35:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tu475575025(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励交流 2014-03-29 21:16:51
tu475575025: 金币+3, 谢谢建议 2014-04-05 19:11:12
你PCR时模板浓度不要太高，尽量保证模板1：1加入。
赞一下(1人) 回复此楼
hehe
14楼2014-03-28 21:25:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tu475575025

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by woolley at 2014-03-28 18:35:58
你可以单独得到AB或者BC，说明你片段中的重叠部分长度啊，退火温度等还是没有问题的，比较可能的问题是模板的比例。
“ABC一起重或者以AB、BC为模板依然无法得到ABC”
如果是A,B,C重叠，你需要测量(OD260)或者跑胶 ...

意见很中肯，我的A、B、C不在同一个模板上，不能直接扩增ABC，所以我打算优化一下PCR体系再试试，另外用模板互为引物p时时退火温度是不是应该低点比较好，而且浓度高些，比如以高浓度的AB、BC互为引物，理论上应该得到相同摩尔量的ABC吧。
赞一下 回复此楼
15楼2014-03-29 13:00:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by d00614028 at 2014-03-27 14:07:56
曾经用NEB的phusion做过4K  4K相加得8K的，也做过3K与200bp相加的，所以我觉得还是比较好的，我没有用过其他的酶。...

您好！我想问一下，我最近在做overlap-pcr，连接的两个片段是3.1kb和4.7kb，用过NEB的Q5和全式金的fast-pfu酶，都没有overlap上，我想问一下，您是如何将两个4kb片段连接成8kb的？除了酶换成Phusion外，其他组分浓度时怎么样的？盼复！谢谢！
赞一下 回复此楼
16楼2014-11-11 09:51:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nirui466

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
17楼2015-05-14 20:46:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小王叨叨

新虫 (初入文坛)
不知道楼主做的如何了？问题是怎么解决的呢？我现在也在做三个片段的融合 也是要不没有条带 要不就是弥散条带，有一次大小对了 然后用融合的片段再P就P不出来了 不知道什么问题啊？求指导
赞一下 回复此楼
18楼2015-12-08 13:19:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 tu475575025 的主题更新
182/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭