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tu475575025新虫 (小有名气)
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[求助]
重叠PCR比想象中的诡异p几十轮了始终没有拿到大片段 已有5人参与
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本人做三个片段A（1000bp---B(2200bp)--C(900bp)的融合pcr，先常规分别回收A、B、C，同源臂19-20bp,重叠之前都是模板互为引物先跑10个循环，再以这些pcr产物为模板进行重叠pcr。 诡异的是，重叠AB可得到单一的目的片段，重叠BC也可以得到单一的目的片段，ABC一起重或者以AB、BC为模板依然无法得到ABC。难道不能重叠4k以上的片段？盼同仁点化中~~~~~~~~~~~~~~ |
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tu475575025
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9楼2014-03-27 15:07:35
biostar2009
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2楼2014-03-27 09:43:59
d00614028
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3楼2014-03-27 10:23:25
tu475575025
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这确实是个办法，是这么个情况：载体上可用位点很少，插入片段中间有一些克隆位点，所以这些位点不能用，我首先将一个片段F连到载体上，另外一共有5个片段要连到一起再与载体连接，因为载体上和片段上能用的酶切位点只有两个，我就设计了D的上游加了一个载体上的位点，E的下游加一个中间酶切位点，DE重叠，然后就是A上游加与E相同的中间酶切位点，ABC重叠，C下游加载体上另一个酶切位点，最后将DE、ABC酶切后与载体连接形成 载体-DE-中间酶切位点-ABC-F-载体(如图) 最后的载体差不多20k了，现在就是卡在ABC重不上了，还不知道这个方案是否能打通。 我用的是takara 的GXL高保真酶，也是可以扩30k的一个酶。NEB的phusion成功率高吗，想请教一下，你们用这个酶重过多大的？  MAP.jpg  MAP1.jpg |
4楼2014-03-27 11:45:45