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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于融合PCR的问题
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thendlee

金虫 (正式写手)

[求助] 关于融合PCR的问题

鄙人在做一个融合PCR，第一个片段约2KB，第二个片段约11KB，重合片段大约在80bp左右，我按照资料里介绍的方法，先分别P出两个独立的片段，然后再不加引物融合8--10个循环，最后拿中间产物加最上游和最下游的引物30循环，可是一直出不来结果，最后跑胶的时候（如图）还是出现两条独立的条带，加样孔倒是特别亮，会不会融合出一条特别长的片段呢？我将融合后的产物纯化回收过，跑胶时上样孔依然很亮，不知道是什么原因，求助各位大神。

注：孔1为15000的marker 孔2、3为融合PCR产物，孔4是另一个PCR产物的对照，以示别的加样孔并不亮

不加引物的体系为：
片段1                        3微升
片段2                        6微升
dNTP                         4
PS buffer                   10
水                 26.5
primestar                   0.5

98度10S   51.6度15S  72度10M  8个循环

加引物的体系
中间产物          5微升
dntp                        5
PS                           10
水                26.5
上游              1.5
下游              1.5
primestar                  0.5

98度10秒 52度15秒 72度11分半
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1楼2012-02-24 10:06:44
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feichen2008

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
thendlee(金币+2): ★有帮助 2012-03-01 15:48:13
两个片段的浓度要大概一致，浓度不要太高，50ng足够。另外长片段不是很好扩，最好选扩长片段的酶。祝好运！
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2楼2012-02-24 11:15:23
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feichen2008

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by thendlee at 2012-03-01 15:47:57:
我做了许多梯度 还是没有出来

有没有换个酶试一下。
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5楼2012-03-02 09:19:56
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feichen2008

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by feichen2008 at 2012-03-02 09:19:56:
有没有换个酶试一下。

你的片段太大，能不能考虑用酶切位点连？
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6楼2012-03-02 09:22:16
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feichen2008

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by feichen2008 at 2012-03-02 09:22:16:
你的片段太大，能不能考虑用酶切位点连？

我仔细看了你的RCR图，你融合之后的片段大小应该是13KB，你跑的带的大小不是也接近15KB的带了吗？你可以把最上面一条带回收回来测个序看看是不是你要的
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7楼2012-03-02 09:26:11
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