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thendlee

金虫 (正式写手)

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[求助] 关于融合PCR的问题

鄙人在做一个融合PCR，第一个片段约2KB，第二个片段约11KB，重合片段大约在80bp左右，我按照资料里介绍的方法，先分别P出两个独立的片段，然后再不加引物融合8--10个循环，最后拿中间产物加最上游和最下游的引物30循环，可是一直出不来结果，最后跑胶的时候（如图）还是出现两条独立的条带，加样孔倒是特别亮，会不会融合出一条特别长的片段呢？我将融合后的产物纯化回收过，跑胶时上样孔依然很亮，不知道是什么原因，求助各位大神。

注：孔1为15000的marker 孔2、3为融合PCR产物，孔4是另一个PCR产物的对照，以示别的加样孔并不亮

不加引物的体系为：
片段1                      3微升
片段2                      6微升
dNTP                      4
PS buffer                10
水                26.5
primestar                0.5

98度10S 51.6度15S  72度10M  8个循环

加引物的体系
中间产物       5微升
dntp                      5
PS                         10
水             26.5
上游             1.5
下游             1.5
primestar                0.5

98度10秒 52度15秒 72度11分半

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1楼2012-02-24 10:06:44

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thendlee

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2楼: Originally posted by feichen2008 at 2012-02-24 11:15:23:
两个片段的浓度要大概一致，浓度不要太高，50ng足够。另外长片段不是很好扩，最好选扩长片段的酶。祝好运！

我做了许多梯度还是没有出来

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4楼2012-03-01 15:47:57

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thendlee

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5楼: Originally posted by feichen2008 at 2012-03-02 09:19:56:
有没有换个酶试一下。

这个倒没有准备试一下

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9楼2012-03-02 15:05:47

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8楼: Originally posted by gongeleven at 2012-03-02 10:46:18:
有的PCR仪有缓慢降温程序，比如0.1度/s，适合overlap的退火

这个情况，片段如此长，我也觉得该考虑其他方法了
可以把11kb的片段分几段PCR出来，再一一拼起。
片段长度差不多的可能更容易拼接。
也可以利用 ...

我后面那个大片段其实就是酶切位点连的在与第一个片段连接的时候发现连不上去板上什么都不长所以才考虑融合PCR

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10楼2012-03-02 15:07:19

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