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thendlee金虫 (正式写手)
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关于融合PCR的问题
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鄙人在做一个融合PCR，第一个片段约2KB，第二个片段约11KB，重合片段大约在80bp左右，我按照资料里介绍的方法，先分别P出两个独立的片段，然后再不加引物融合8--10个循环，最后拿中间产物加最上游和最下游的引物30循环，可是一直出不来结果，最后跑胶的时候（如图）还是出现两条独立的条带，加样孔倒是特别亮，会不会融合出一条特别长的片段呢？我将融合后的产物纯化回收过，跑胶时上样孔依然很亮，不知道是什么原因，求助各位大神。 注：孔1为15000的marker 孔2、3为融合PCR产物，孔4是另一个PCR产物的对照，以示别的加样孔并不亮 不加引物的体系为： 片段1 3微升 片段2 6微升 dNTP 4 PS buffer 10 水 26.5 primestar 0.5 98度10S 51.6度15S 72度10M 8个循环 加引物的体系 中间产物 5微升 dntp 5 PS 10 水 26.5 上游 1.5 下游 1.5 primestar 0.5 98度10秒 52度15秒 72度11分半  |
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thendlee
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
thendlee(金币+2): ★有帮助 说实话 我第一次做这个融合PCR的时候成功了 但是一个星期之后再做却怎么也出不来了 2012-03-01 15:49:16
感谢参与，应助指数 +1
thendlee(金币+2): ★有帮助 说实话 我第一次做这个融合PCR的时候成功了 但是一个星期之后再做却怎么也出不来了 2012-03-01 15:49:16
| 建议不加引物不要51.6度那一步，PCR仪降温很快，快速降温会影响DNA复性，这可能就是造成加样空里面没有跑出来的原因。我做片段（8KB左右）融合时是把两个片段一起加进去做模板，直接做加引物PCR的那步，不过由于这个过程包括了不加引物的那步的退火，像你的都有80bp，所以退火温度用高点，60度以上，也可以两步，第一个有高温度退火5个循环，后面再用低温退火进行扩增。融合的两个片段最好大小差不多，摩尔量也差不多，有助于融合成功。 |
3楼2012-02-24 13:53:45
thendlee
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4楼2012-03-01 15:47:57