应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 将质粒上紧挨着的两个酶切位点进行双酶切后连接外源基因片段，是不是不好连接？
141/2返回列表12下一页
查看: 5932  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

蜗牛061610

木虫 (小有名气)

1

[求助] 将质粒上紧挨着的两个酶切位点进行双酶切后连接外源基因片段，是不是不好连接？

有人说如果质粒上两个切点紧挨着的话，双酶切容易切错。我就先用一个酶进行酶切，切完后过pcr纯化试剂盒后用第二个酶进行酶切，再过pcr纯化试剂盒进行酶连。酶连了两批，挑去转化子抽取质粒进行pcr鉴定都是假阳性，搞不清楚是什么原因。

[ 来自科研家族 化学生物学 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1
1楼 2011-10-09 14:13:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

amilie030312

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助发帖！ 2011-10-09 20:19:42
蜗牛061610(金币+2): 谢谢交流 2011-10-10 08:29:41
两个酶切位点挨的近那是有多近啊？质粒要计算保护碱基的话要计算保护碱基对不是保护碱基个数，如果保护碱基不够酶切就没办法切好，我有疑问的是你为啥每次酶切完了都要回收一下，质粒损失多大啊。另外，连接如果连接不上看是否是酶切的末端有平也有粘，这样不太好连的，最好两边都是4碱基突出的粘端是最好连的。至于假阳性，出现这个结果的可能性还真不是一句两句说得清的，一个问题一个问题排除吧。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-10-09 14:30:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流！ 2011-10-09 20:19:50
这个很有可能是载体没有切好所致，你最好翻一下酶的说明书，两个挨在一起的位点酶切时是有顺序要求的，不对的话很容易不完全，产生的多是载体自连的克隆，如果有选择的话建议换个载体或者换换酶切位点的好
赞一下(1人) 回复此楼
在等待中涅槃重生
3楼2011-10-09 16:41:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hf2016

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

酷似您这是不好酶切的原因比达大
赞一下 回复此楼
一切开始于结束之后
4楼2011-10-09 21:18:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-10-09 23:00:36
两个酶切位点太近的话会出现保护碱基不够的情况，所以很有可能是质粒没有切好，出现这个情况解决的办法不多呀，你最好还是换个离的稍远一点的酶切位点试试吧
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-10-09 22:12:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蜗牛061610

木虫 (小有名气)

1
引用回帖:
2楼: Originally posted by amilie030312 at 2011-10-09 14:30:25:
两个酶切位点挨的近那是有多近啊？质粒要计算保护碱基的话要计算保护碱基对不是保护碱基个数，如果保护碱基不够酶切就没办法切好，我有疑问的是你为啥每次酶切完了都要回收一下，质粒损失多大啊。另外，连接如果连 ...

我看了下序列，两个切点是紧挨着的，中间没有保护碱基。因为两个酶用的buffer不一样，一个酶切完以后得回收质粒再切。不回收就不能用第二个酶进行酶切。切点分别是xho1和kpn1，都是粘性末端。
赞一下 回复此楼
1
6楼2011-10-10 08:19:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蜗牛061610

木虫 (小有名气)

1
引用回帖:
5楼: Originally posted by ganchao1776 at 2011-10-09 22:12:43:
两个酶切位点太近的话会出现保护碱基不够的情况，所以很有可能是质粒没有切好，出现这个情况解决的办法不多呀，你最好还是换个离的稍远一点的酶切位点试试吧

貌似只能换换了，当初连接是想连接T载，后来连接T载效率很低（我是将左右中三个片段和T载连，左右两个片段和T载就竞争性结合，使得连接的效率很低），就想着连接质粒，当时就傻了：这两个切点我们实验室只有一个质粒能用，而且两个切点还都紧挨着
赞一下 回复此楼
1
7楼2011-10-10 08:26:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

amilie030312

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 蜗牛061610 at 2011-10-10 08:19:46:
我看了下序列，两个切点是紧挨着的，中间没有保护碱基。因为两个酶用的buffer不一样，一个酶切完以后得回收质粒再切。不回收就不能用第二个酶进行酶切。切点分别是xho1和kpn1，都是粘性末端。

XhoI和KpnI是可以同一种Buffer的啊，你看
赞一下 回复此楼
8楼2011-10-12 13:01:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lw19850128

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2313510楼: Originally posted by yuxia82012 at 2011-10-09 16:41:11
这个很有可能是载体没有切好所致，你最好翻一下酶的说明书，两个挨在一起的位点酶切时是有顺序要求的，不对的话很容易不完全，产生的多是载体自连的克隆，如果有选择的话建议换个载体或者换换酶切位点的好

我之前也是遇到这个问题，不过换了下两个酶的先后顺序解决了。楼主条克隆呈假阳性建议多作对照，把酶切产物做个转化对照看看，感受态也做个阴性对照看看~
赞一下 回复此楼
9楼2012-07-10 12:51:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

erlangshen89

木虫 (小有名气)
不同顺序酶切的话还用先回收再用另一个酶切还是直接再加入另一个酶？
赞一下 回复此楼
10楼2013-08-09 10:56:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 蜗牛061610 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +7 349506619 2026-08-28 7/350 2026-08-31 13:39 by 冼亮淀粉酶
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭