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如何将miRNA构建到慢病毒载体
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| 如何将miRNA构建到慢病毒载体？以前只做过将基因构建到质粒载体，两者有什么区别？最好有具体的实验步骤，或相关资料，不胜感激！ |
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cdl007
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
西瓜(金币+3, MolEPI+1): Good 2011-09-04 18:56:06
tutufei(金币+5): 多谢 2011-09-08 16:21:30
西瓜(金币+3, MolEPI+1): Good 2011-09-04 18:56:06
tutufei(金币+5): 多谢 2011-09-08 16:21:30
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一个说明书上的内容，相当简单好理解 慢病毒包装简要程序(以六孔板中的1孔为例)： 第一天： 1.用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度 第二天： 1.转染293FT细胞。 1. 500ul Opti-MEM稀释2ug pWPXLd-目的基因+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G 2. 500ul Opti-MEM稀释15ul lipofectamine2000 3. 5min后，将，溶液混合，室温静止30min 4. 从6孔板中吸出1ml培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。 2. 6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+ 10%FBS（从此刻开始算时间）。 第三天： 3.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上 第四天： 4. 48h收获含病毒的上清，0.45um滤膜过滤， 同时再往6孔板中加入2ml完全培养基 4. 感染细胞：用一份病毒液+2份完全培养基感染目的细胞。 第五天： 5. 72h后再次收获病毒上清。将昨天感染的细胞离心去除上清，然后再次感染目的细胞。 6. 一般感染48h后，就能见到明显的荧光。 |
2楼2011-09-04 18:41:16
cdl007
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【答案】应助回帖
★ ★
dhd997(金币+2): 专家就是专家 2011-09-09 07:46:49
dhd997(金币+2): 专家就是专家 2011-09-09 07:46:49
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http://www.stemcell8.cn/forum-viewthread-tid-41159-highlight.html 这个网址上的更详细，，俺倒是想做，可惜实验室条件不够。。。。。 |
3楼2011-09-04 18:59:41
l-c-l
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jinanfendou
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9楼2012-11-06 14:04:10
10
