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tutufei

铜虫 (小有名气)

[求助] 如何将miRNA构建到慢病毒载体

如何将miRNA构建到慢病毒载体？以前只做过将基因构建到质粒载体，两者有什么区别？最好有具体的实验步骤，或相关资料，不胜感激！
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1楼 2011-09-04 16:54:57
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l-c-l

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励交流 2011-09-07 17:17:21
慢病毒构建实验条件要求并不高，只要能弄到所需的载体就比较简单了。载体构建部分就是常规的分子生物学技术，最主要是看包装效率，要求较高的就是氯化钙了，基本用进口的高纯才可以（当然不选用该系统不作考虑）。若是包装效率好的话，得到的毒液滴度也是足够感染Jurkat等难以转染的白血病等细胞株，此时可以不经过浓缩，因为浓缩需要超高速离心（8万），这个还是比较难办的。
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4楼2011-09-07 15:46:55
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3, MolEPI+1): Good 2011-09-04 18:56:06
tutufei(金币+5): 多谢 2011-09-08 16:21:30
一个说明书上的内容，相当简单好理解


慢病毒包装简要程序(以六孔板中的1孔为例)：

第一天：
1.用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度
第二天：                       
1.转染293FT细胞。
  1. 500ul Opti-MEM稀释2ug pWPXLd-目的基因+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G
  2. 500ul Opti-MEM稀释15ul lipofectamine2000
  3. 5min后，将，溶液混合，室温静止30min       
  4. 从6孔板中吸出1ml培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。
2. 6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+   
   10%FBS（从此刻开始算时间）。
第三天：
3.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上
第四天：
4. 48h收获含病毒的上清，0.45um滤膜过滤， 同时再往6孔板中加入2ml完全培养基
4. 感染细胞：用一份病毒液+2份完全培养基感染目的细胞。
第五天：
5. 72h后再次收获病毒上清。将昨天感染的细胞离心去除上清，然后再次感染目的细胞。
6. 一般感染48h后，就能见到明显的荧光。
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2楼2011-09-04 18:41:16
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 专家就是专家 2011-09-09 07:46:49
http://www.stemcell8.cn/forum-viewthread-tid-41159-highlight.html

这个网址上的更详细，，俺倒是想做，可惜实验室条件不够。。。。。
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3楼2011-09-04 18:59:41
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tutufei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by l-c-l at 2011-09-07 15:46:55:
慢病毒构建实验条件要求并不高，只要能弄到所需的载体就比较简单了。载体构建部分就是常规的分子生物学技术，最主要是看包装效率，要求较高的就是氯化钙了，基本用进口的高纯才可以（当然不选用该系统不作考虑）。 ...

慢病毒载体是双链还是单链？RNA？
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5楼2011-09-08 14:44:54
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