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tutufei

铜虫 (小有名气)

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[求助] 如何将miRNA构建到慢病毒载体

如何将miRNA构建到慢病毒载体？以前只做过将基因构建到质粒载体，两者有什么区别？最好有具体的实验步骤，或相关资料，不胜感激！

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1楼2011-09-04 16:54:57

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cdl007

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3, MolEPI+1): Good 2011-09-04 18:56:06
tutufei(金币+5): 多谢 2011-09-08 16:21:30

一个说明书上的内容，相当简单好理解

慢病毒包装简要程序(以六孔板中的1孔为例)：

第一天：
1.用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度
第二天：
1.转染293FT细胞。
  1. 500ul Opti-MEM稀释2ug pWPXLd-目的基因+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G
  2. 500ul Opti-MEM稀释15ul lipofectamine2000
  3. 5min后，将，溶液混合，室温静止30min
  4. 从6孔板中吸出1ml培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。
2. 6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+
10%FBS（从此刻开始算时间）。
第三天：
3.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上
第四天：
4. 48h收获含病毒的上清，0.45um滤膜过滤，同时再往6孔板中加入2ml完全培养基
4. 感染细胞：用一份病毒液+2份完全培养基感染目的细胞。
第五天：
5. 72h后再次收获病毒上清。将昨天感染的细胞离心去除上清，然后再次感染目的细胞。
6. 一般感染48h后，就能见到明显的荧光。