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天使托

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T.Shen

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【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): 鼓励 2011-05-28 19:30:15

1：载体和基因酶切是否完全呢？可以上图看看
2：连接体系如何？时间呢？
3：感受态细胞的活性呢？
4：也不定用菌液做，可以用划到板子上的菌裂解后当模板的；
5：上图，我来看看。如果没有连接上，应该不会有条带的，为什么还会P出来一条1000bp的条带呢？难道是非特异性的？

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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!

2楼2011-05-28 15:37:34

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andy99990000

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
qyqy512(金币+1): 谢谢 2011-05-30 08:34:00
wanhscn(金币+3, MolEPI+1): Good！对楼主有帮助！经决定，授予专家指数。 2011-09-24 08:48:00

楼主可以提供下克隆载体的大小吗？如果我估计的没错，应该是空载的假阳性（or 只转化进了极少目的片段，所以能够用你的特异引物扩增），测序后就是你的载体片段。
这种情况我遇到过，我当时的PCR目的片段1200bp，但是最后筛选出来，1000bp和1200bp都有，我当时以为片段在不同种中的差异很大，就都测序了一些。结果1000bp的是空载的假阳性。
建议楼主也可以送一两个样测测序，毕竟也不贵。再就是优化连接及转化条件，减少假阳性的概率。
个人经验，希望有所帮助~~

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7楼2011-05-30 00:13:42

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