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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求帮忙分析下菌液PCR检测结果
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faile18

金虫 (小有名气)

[求助] 求帮忙分析下菌液PCR检测结果

各位同志，图是我挑选单克隆之后菌液PCR的结果，上半部分为一个基因大小2168bp，下半部分基因大小1527bp。从图上看，只有基因2只有2.5可能有目的条带，基因6中6.2.1-6.2.5均有1500bp左右片段，但亮度不够。最近的单克隆经常出现这种情况，要么亮度不够，要么不是目的条带，请各位大侠帮忙分析下出现这种情况的原因及可能的解决办法，不胜感激。
ps：连接的目的基因是通过PCR扩增、切胶回收得到，连接前电泳检测过，条带单一。
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1楼 2011-10-08 19:57:15
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓
引用回帖:
4697231楼: Originally posted by qj900302 at 2012-09-28 22:42:05
我是新手 想问一下怎么样裂解菌体成为模板啊？...

我建议，在平板上多挑取一些单克隆，用1.0ml LB液体培养基在1.5ml Ep管中培养10-15h（摇床培养时，最好倒置Ep管），然后取1-2ul做模板常规PCR扩增。
对于E.coli，只要在PCR程序的第一变性时间延长5min就可以了裂解菌体。

有问题，可以随时和我联系。谢谢。
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20楼2012-10-01 17:23:19
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wen19870427

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-10-08 21:29:45
检测基因6用的引物不够特异，重新设计引物
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2楼2011-10-08 20:48:03
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aayqaa

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

情况比较复杂，干脆提下质粒重新p下好了
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3楼2011-10-08 21:12:01
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双鱼猫咪

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-10-09 07:57:33
请问检测的用的是特异引物还是通用引物，如果是通用引物，P出来的片段会比目的片段稍大一点。菌液PCR本身假阳性就很高，最好用质粒PCR，结合酶切鉴定，会使成功率提高
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5楼2011-10-08 21:55:48
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