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[求助]
求帮忙分析下菌液PCR检测结果
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各位同志，图是我挑选单克隆之后菌液PCR的结果，上半部分为一个基因大小2168bp，下半部分基因大小1527bp。从图上看，只有基因2只有2.5可能有目的条带，基因6中6.2.1-6.2.5均有1500bp左右片段，但亮度不够。最近的单克隆经常出现这种情况，要么亮度不够，要么不是目的条带，请各位大侠帮忙分析下出现这种情况的原因及可能的解决办法，不胜感激。 ps：连接的目的基因是通过PCR扩增、切胶回收得到，连接前电泳检测过，条带单一。  |
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5楼2011-10-08 21:55:48
2楼2011-10-08 20:48:03
3楼2011-10-08 21:12:01
bioartist
木虫 (正式写手)
无菌草莓
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【答案】应助回帖
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dhd997(金币+5, MolEPI+1): 鼓励，可以开专贴，单独讨论下，集思广益 2011-10-09 07:58:13
faile18(金币+10): 2011-10-09 21:22:56
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 鼓励，可以开专贴，单独讨论下，集思广益 2011-10-09 07:58:13
faile18(金币+10): 2011-10-09 21:22:56
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我之前探讨过类似的问题了，今天在小议一下： 1. 楼主的问题说的不是很清楚。用的是什么载体？菌液PCR是如何选用引物的？退火温度是怎么选择的？ 这种电泳结果说明，你的引物特异性不是很高，引物可能在转化菌株的基因组上又结合位点。上面那个图中，有你要的目的条带，但是有些条带不是很清楚，原因可能很多，如模板量、DNA聚合酶用量的差异的等。这个可以不用管，这个实验是有和无的关系，可以选三个有目的带的样品测序，最终结果是以测序为准的，菌体PCR只是初步筛选的过程。 2. 感觉是你引物选用的不对。我们常用的载体上都用通用的测序引物（如如M13F、M13R、T7、Sp6等，若真没有，可以自行设计一条20bp左右的引物），可以和你目的片段的一条引物配对，这个可以以没有外源片段的载体作对照，这样获得的结果可行对比较高。不能直接用扩增你目的片段的方法，没有说服力； 3. 菌体电泳，直接用碱裂解法的溶液I和溶液II裂解菌体后，进行电泳，以没有外源片段的载体作对照，条带相对滞后样品就是应该是连入外源片段的。 4. 可以酶切载体，再以没有连接外源片段载体的酶切产物作对照。这个方法比较麻烦，不推荐。 通过这几种方法筛选到的阳性克隆，直接以菌体送去测序公司测序分析。你所要的阳性克隆，最终还是要通过测序结果的序列分析确定。 |
6楼2011-10-08 22:03:39
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