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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求帮忙分析下菌液PCR检测结果
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faile18

金虫 (小有名气)

[求助] 求帮忙分析下菌液PCR检测结果

各位同志，图是我挑选单克隆之后菌液PCR的结果，上半部分为一个基因大小2168bp，下半部分基因大小1527bp。从图上看，只有基因2只有2.5可能有目的条带，基因6中6.2.1-6.2.5均有1500bp左右片段，但亮度不够。最近的单克隆经常出现这种情况，要么亮度不够，要么不是目的条带，请各位大侠帮忙分析下出现这种情况的原因及可能的解决办法，不胜感激。
ps：连接的目的基因是通过PCR扩增、切胶回收得到，连接前电泳检测过，条带单一。
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1楼 2011-10-08 19:57:15
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by haijyang at 2011-10-08 22:29:27:
直接以菌液为模板通过PCR扩增目的基因来检测连接情况很简单，建议设计引物，扩增片段小一点，PCR用25微升体系，1微升模板就可以了

我也了解整个操作过程及原理比较简单，但是我做出来的就是这样的结果，而且类似的其他基因也出现这种情况，我体系用的是20微升，模板1微升
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9楼2011-10-09 21:04:20
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wen19870427

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-10-08 21:29:45
检测基因6用的引物不够特异，重新设计引物
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2楼2011-10-08 20:48:03
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aayqaa

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

情况比较复杂，干脆提下质粒重新p下好了
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3楼2011-10-08 21:12:01
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双鱼猫咪

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-10-09 07:57:33
请问检测的用的是特异引物还是通用引物，如果是通用引物，P出来的片段会比目的片段稍大一点。菌液PCR本身假阳性就很高，最好用质粒PCR，结合酶切鉴定，会使成功率提高
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5楼2011-10-08 21:55:48
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