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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 点突变引物设计的问题
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

[交流] 点突变引物设计的问题

我突变了一个氨基酸，设计的引物照着说明书设计的，两条完全互补的引物，有个问题是为什么突变点两边都必须有一定长度的重叠区呢？这样的话PCR形成引物二聚体的可能性就大了啊？
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1楼2012-05-23 15:05:46
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回帖置顶 ( 共有1个 )

小猫三两只

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+4, MolEPI+1, Good！ 2012-05-23 22:34:07
设计点突变的引物应该是让中间的某个氨基酸突变吧，这样你就需要4条引物，基因全长的上下游引物以及点突变上的两条引物（一条上游一条下游），首先要用全长基因的上游引物和突变位置的下游引物扩增得到前面的序列，再用突变位置的上游引物和全长基因的下游引物扩增后面的序列，得到的这两部分片段按照1：1混合作模板，用全长基因的上下游引物扩增。因为这两段是分离的，要想得到全长，那么中间的引物肯定要一定的重叠区，才能保证延伸时得到全长。在扩增的过程中并没有中间两条引物同时加入一个反应体系中扩增的情况出现，因此也就不会出现二聚体。
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3楼2012-05-23 15:32:08
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Diacetyl

铁虫 (初入文坛)
★ ★ ★
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-23 22:34:18
SOE法点突变过程示意

SOE法点突变过程示意
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4楼2012-05-23 21:50:26
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thinkdoll

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-24 13:55:54
loveskyzhou: 金币+1, 对对，就是这个问题~ 有人说P出来的带可能会很浅 所以即便跑胶看不到也可以转化。我做的时候确实看不到，而引物二聚体却很明显，转化后确实长了单克隆，但都提不出质粒来。。。很困惑啊~ 2012-05-24 14:35:48
小猫回答的虽然对，但不是楼主问的问题。
楼主要做的是一步的点突变。用两条完全互补的引物将整个质粒pcr扩增出来。扩增得到的缺刻质粒转化至带有基因修复功能的dam+型细菌中，修复成完整的质粒。
楼主你放心做吧，没有问题的。我所做的成功率都非常高。你说的引物二聚体问题也有人做过改进
参考文献 L Zheng, U Baumann, and JL Reymond.   An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis
protocol. Nucl. Acids Res., 32:e115, 2004.
但一般情况下，常规方法都能满足。
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5楼2012-05-24 13:54:28
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普通回帖

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+1, 专家考核, 鼓励交流 2012-05-23 22:33:24
你说的没错，但确实是这么做的，也能做出来，有一定长度的重叠区无法保证位点突变，不要纠结引物二聚体的形成。
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2楼2012-05-23 15:29:12
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wanggl2004

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
其实控制好pcr的条件，没二聚体的
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6楼2012-05-24 21:19:06
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-05-23 15:32:08:
设计点突变的引物应该是让中间的某个氨基酸突变吧，这样你就需要4条引物，基因全长的上下游引物以及点突变上的两条引物（一条上游一条下游），首先要用全长基因的上游引物和突变位置的下游引物扩增得到前面的序列，

恩，谢谢，但我的方法有点不同~
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7楼2012-05-24 23:02:11
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-25 13:43:40
按照说明书设计 根本不用考虑引物的情况 扩增之后即使有杂带 也可以用DMT酶消化 然后转化就可以了 没有问题 不用怀疑引物
我已经做了很多突变了
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8楼2012-05-25 08:29:10
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Kyle0052

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有引物二聚体也没关系，在做完转化后就给筛选掉了
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9楼2014-06-13 15:26:56
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tea11111

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by thinkdoll at 2012-05-24 13:54:28
小猫回答的虽然对，但不是楼主问的问题。
楼主要做的是一步的点突变。用两条完全互补的引物将整个质粒pcr扩增出来。扩增得到的缺刻质粒转化至带有基因修复功能的dam+型细菌中，修复成完整的质粒。
楼主你放心做吧 ...

你好，我想请问，全质粒PCR后，需要验证是否PCR成功吗，如何验证？还是直接转化，再筛选？
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10楼2015-06-20 17:40:09
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云破月来xxz

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by tea11111 at 2015-06-20 17:40:09
你好，我想请问，全质粒PCR后，需要验证是否PCR成功吗，如何验证？还是直接转化，再筛选？...

问题解决了吧？PCR点突变后的质粒琼脂糖凝胶电泳后，不知道那条条带是目的产物啊？
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11楼2015-07-19 15:54:20
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潇溦

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by snzydong at 2012-05-25 08:29:10
按照说明书设计 根本不用考虑引物的情况 扩增之后即使有杂带 也可以用DMT酶消化 然后转化就可以了 没有问题 不用怀疑引物
我已经做了很多突变了

用点突变试剂盒，退火温度需要自己摸吗？谢谢
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12楼2016-03-18 16:21:49
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