| 查看: 6749 | 回复: 11 | |||||||||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||||||||
[交流]
点突变引物设计的问题
|
|||||||||
| 我突变了一个氨基酸，设计的引物照着说明书设计的，两条完全互补的引物，有个问题是为什么突变点两边都必须有一定长度的重叠区呢？这样的话PCR形成引物二聚体的可能性就大了啊？ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 | 先进材料与分子模拟 | 【分子生物】EPI帖 | 有价值的生物经验贴 |
| 噬菌体库筛选 | 核酸方面 |
» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有140人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有8人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 定点突变引物设计
已经有8人回复
- 关于引物设计的问题
已经有5人回复
- 引物设计的问题
已经有13人回复
- 引物设计的问题
已经有6人回复
- 引物设计
已经有4人回复
- 做蛋白体外表达时的引物设计问题！
已经有12人回复
- 【求助/交流】两条序列只有1-2个变异位点，能设计特异引物区别出来吗？
已经有23人回复
- 【求助/交流】引物设计的 序列选择问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】定点突变引物设计问题
已经有7人回复
- 【求助/交流】关于启动子缺失的引物设计问题
已经有4人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
陕西科技大学轻工科学与工程学院硕士调剂
+5/505
-
安徽省大别山中医药研究院 接收中药调剂生（中药、药学等10开头代码均可）
+1/77
-
天津商业大学接收2026生物、食品类硕士研究生调剂
+2/56
-
江苏海洋大学+环境与化学工程学院+课题组招调剂生+第一批调剂
+2/52
-
生物化工学硕招收调剂
+1/41
-
常州大学-环境科学与工程学院招收环境工程学硕和专硕调剂-网络复试-多学科
+1/38
-
招收地理类、环境类、地化类、生物类、土壤类、农业资源与环境等硕士调剂生
+1/11
-
橡胶草种子求助
+1/10
-
中国地震局地质研究所+地球物理/数学+接收调剂
+1/9
-
重庆工商大学 招收环境/材料类方向调剂研究生
+1/9
-
浙江农林大学-桂金山课题组（植物细胞壁-生物质与生物能源）-2026年硕士研究生调剂
+1/8
-
大连工业大学招生 08工学：化工、环境、材料 07理学:化学 调剂招生！
+1/8
-
重庆工商大学 教育部研究中心招收化工/环境/材料/石油/机械方向2026年调剂研究生
+1/7
-
0854,0858调剂招生
+1/7
-
招调剂_北京农学院_植物保护系_昆虫方向_专硕_学硕各1名
+1/6
-
总分338求调剂，本科大连理工一志愿北航生医工083100
+1/6
-
2026年江西科技师范大学Tide课题组招收化学、生物、药学、材料相关学硕或专硕调剂生
+1/3
-
大连工业杰青、长江团队-生物质材料方向招收2026级博士生
+1/3
-
军事医学研究员毒物药物研究所药理学生物技术药物代谢方向招收调剂生 4名
+1/3
-
广东工业大学生态环境与海洋学院 杨盼教授团队招收博士研究生
+1/1
★ ★ ★ ★ ★
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+4, MolEPI+1, Good！ 2012-05-23 22:34:07
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+4, MolEPI+1, Good！ 2012-05-23 22:34:07
| 设计点突变的引物应该是让中间的某个氨基酸突变吧，这样你就需要4条引物，基因全长的上下游引物以及点突变上的两条引物（一条上游一条下游），首先要用全长基因的上游引物和突变位置的下游引物扩增得到前面的序列，再用突变位置的上游引物和全长基因的下游引物扩增后面的序列，得到的这两部分片段按照1：1混合作模板，用全长基因的上下游引物扩增。因为这两段是分离的，要想得到全长，那么中间的引物肯定要一定的重叠区，才能保证延伸时得到全长。在扩增的过程中并没有中间两条引物同时加入一个反应体系中扩增的情况出现，因此也就不会出现二聚体。 |
3楼2012-05-23 15:32:08
4楼2012-05-23 21:50:26
★ ★ ★ ★
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-24 13:55:54
loveskyzhou: 金币+1, 对对，就是这个问题~ 有人说P出来的带可能会很浅 所以即便跑胶看不到也可以转化。我做的时候确实看不到，而引物二聚体却很明显，转化后确实长了单克隆，但都提不出质粒来。。。很困惑啊~ 2012-05-24 14:35:48
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-24 13:55:54
loveskyzhou: 金币+1, 对对，就是这个问题~ 有人说P出来的带可能会很浅 所以即便跑胶看不到也可以转化。我做的时候确实看不到，而引物二聚体却很明显，转化后确实长了单克隆，但都提不出质粒来。。。很困惑啊~ 2012-05-24 14:35:48
|
小猫回答的虽然对，但不是楼主问的问题。 楼主要做的是一步的点突变。用两条完全互补的引物将整个质粒pcr扩增出来。扩增得到的缺刻质粒转化至带有基因修复功能的dam+型细菌中，修复成完整的质粒。 楼主你放心做吧，没有问题的。我所做的成功率都非常高。你说的引物二聚体问题也有人做过改进 参考文献 L Zheng, U Baumann, and JL Reymond. An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol. Nucl. Acids Res., 32:e115, 2004. 但一般情况下，常规方法都能满足。 |
5楼2012-05-24 13:54:28
2楼2012-05-23 15:29:12
6楼2012-05-24 21:19:06
7楼2012-05-24 23:02:11
8楼2012-05-25 08:29:10
9楼2014-06-13 15:26:56
10楼2015-06-20 17:40:09
11楼2015-07-19 15:54:20
12楼2016-03-18 16:21:49
