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[交流]
点突变引物设计的问题
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| 我突变了一个氨基酸，设计的引物照着说明书设计的，两条完全互补的引物，有个问题是为什么突变点两边都必须有一定长度的重叠区呢？这样的话PCR形成引物二聚体的可能性就大了啊？ |
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★ ★ ★ ★ ★
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+4, MolEPI+1, Good！ 2012-05-23 22:34:07
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+4, MolEPI+1, Good！ 2012-05-23 22:34:07
| 设计点突变的引物应该是让中间的某个氨基酸突变吧，这样你就需要4条引物，基因全长的上下游引物以及点突变上的两条引物（一条上游一条下游），首先要用全长基因的上游引物和突变位置的下游引物扩增得到前面的序列，再用突变位置的上游引物和全长基因的下游引物扩增后面的序列，得到的这两部分片段按照1：1混合作模板，用全长基因的上下游引物扩增。因为这两段是分离的，要想得到全长，那么中间的引物肯定要一定的重叠区，才能保证延伸时得到全长。在扩增的过程中并没有中间两条引物同时加入一个反应体系中扩增的情况出现，因此也就不会出现二聚体。 |
3楼2012-05-23 15:32:08
4楼2012-05-23 21:50:26
★ ★ ★ ★
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-24 13:55:54
loveskyzhou: 金币+1, 对对，就是这个问题~ 有人说P出来的带可能会很浅 所以即便跑胶看不到也可以转化。我做的时候确实看不到，而引物二聚体却很明显，转化后确实长了单克隆，但都提不出质粒来。。。很困惑啊~ 2012-05-24 14:35:48
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-24 13:55:54
loveskyzhou: 金币+1, 对对，就是这个问题~ 有人说P出来的带可能会很浅 所以即便跑胶看不到也可以转化。我做的时候确实看不到，而引物二聚体却很明显，转化后确实长了单克隆，但都提不出质粒来。。。很困惑啊~ 2012-05-24 14:35:48
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小猫回答的虽然对，但不是楼主问的问题。 楼主要做的是一步的点突变。用两条完全互补的引物将整个质粒pcr扩增出来。扩增得到的缺刻质粒转化至带有基因修复功能的dam+型细菌中，修复成完整的质粒。 楼主你放心做吧，没有问题的。我所做的成功率都非常高。你说的引物二聚体问题也有人做过改进 参考文献 L Zheng, U Baumann, and JL Reymond. An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol. Nucl. Acids Res., 32:e115, 2004. 但一般情况下，常规方法都能满足。 |
5楼2012-05-24 13:54:28
2楼2012-05-23 15:29:12
6楼2012-05-24 21:19:06
7楼2012-05-24 23:02:11
8楼2012-05-25 08:29:10
9楼2014-06-13 15:26:56
10楼2015-06-20 17:40:09
11楼2015-07-19 15:54:20
12楼2016-03-18 16:21:49