| 查看: 6998 | 回复: 11 | |||||||||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||||||||
[交流]
点突变引物设计的问题
|
|||||||||
| 我突变了一个氨基酸，设计的引物照着说明书设计的，两条完全互补的引物，有个问题是为什么突变点两边都必须有一定长度的重叠区呢？这样的话PCR形成引物二聚体的可能性就大了啊？ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 | 先进材料与分子模拟 | 【分子生物】EPI帖 | 有价值的生物经验贴 |
| 噬菌体库筛选 | 核酸方面 |
» 猜你喜欢
莫那利珠单抗阻断NKG2A/HLA-E抑制通路 | Biochempartner
已经有0人回复
-
GSPT1口服分子胶降解剂MRT-2359 | Biochempartner
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有56人回复
-
碳青霉烯类抗生素为何需联用西司他丁钠？ | Biochempartner
已经有0人回复
-
源自蕨类植物的抗炎美白活性分子去甲氧基荚果蕨素 | Biochempartner
已经有0人回复
-
肠道里的"代谢开关"：Fexaramine用肠道限制性重新定义 FXR 激动剂
已经有0人回复
-
DMXAA：从血管破坏剂到STING通路研究的关键工具分子 | Biochempartner
已经有0人回复
-
靶向PD-L1的人源化单克隆抗体阿特珠单抗
已经有0人回复
-
"探针之父"(+)-JQ-1如何改变表观遗传研究 | Biochempartner
已经有0人回复
-
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 定点突变引物设计
已经有8人回复
- 关于引物设计的问题
已经有5人回复
- 引物设计的问题
已经有13人回复
- 引物设计的问题
已经有6人回复
- 引物设计
已经有4人回复
- 做蛋白体外表达时的引物设计问题！
已经有12人回复
- 【求助/交流】两条序列只有1-2个变异位点，能设计特异引物区别出来吗？
已经有23人回复
- 【求助/交流】引物设计的 序列选择问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】定点突变引物设计问题
已经有7人回复
- 【求助/交流】关于启动子缺失的引物设计问题
已经有4人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
电池技术研发专家
+1/76
-
求助USP <1664> 2026版本 Assessdrproduct
+1/46
-
华南理工大学电力学院雪映教授招收博士生（2027年秋季入学）
+2/46
-
祈祷面上基金能中
+1/34
-
浙江大学衢州研究院肖成梁课题组招聘博士后及科研助理
+1/34
-
四川大学华西医院高瞻课题组诚聘博后、博士/硕士生及科研助理 （柔性医疗电子）
+1/32
-
哈工大 化工学院招2026年秋季快速响应博士生，2027年3月或9月考核入学博士生
+1/32
-
吉林大学-电池物理教育部实验室-招收2027级-能源电池-博士研究生
+1/31
-
中山大学-中法核工程与技术学院-辐射探测与核电子学课题组招收博士生
+1/28
-
研究所招聘科研/实验助理一名
+1/28
-
国家纳米科学中心鄢勇课题组2027年博士招生
+1/27
-
南科大活性流体和软物质课题组诚招2027级博士、硕士研究生和博后
+1/26
-
浙江大学-化工学院刘平伟课题组-二维材料/功能聚合物开发-博后招聘
+1/17
-
澳大利亚昆士兰大学（UQ）】全奖PhD招生：碳捕集与液流电池储能方向
+1/12
-
昆士兰大学陈鹏课题组博士招生（2027年入学）
+1/7
-
赫尔辛基大学Hematoscope Lab招PhD
+1/7
-
圣路易斯华盛顿大学管建均教授课题组招聘博士后（2名）
+1/5
-
中南大学化学化工学院招收电池储能、理论计算方向博士生
+1/4
-
***超龄的未婚大叔希望能找到女结婚对象（沪深周围）
+2/4
-
单细胞转录组联合蛋白组检测：突破单一组学边界，重塑细胞分群精度
+1/2
★ ★ ★ ★ ★
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+4, MolEPI+1, Good！ 2012-05-23 22:34:07
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+4, MolEPI+1, Good！ 2012-05-23 22:34:07
| 设计点突变的引物应该是让中间的某个氨基酸突变吧，这样你就需要4条引物，基因全长的上下游引物以及点突变上的两条引物（一条上游一条下游），首先要用全长基因的上游引物和突变位置的下游引物扩增得到前面的序列，再用突变位置的上游引物和全长基因的下游引物扩增后面的序列，得到的这两部分片段按照1：1混合作模板，用全长基因的上下游引物扩增。因为这两段是分离的，要想得到全长，那么中间的引物肯定要一定的重叠区，才能保证延伸时得到全长。在扩增的过程中并没有中间两条引物同时加入一个反应体系中扩增的情况出现，因此也就不会出现二聚体。 |
3楼2012-05-23 15:32:08
4楼2012-05-23 21:50:26
★ ★ ★ ★
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-24 13:55:54
loveskyzhou: 金币+1, 对对，就是这个问题~ 有人说P出来的带可能会很浅 所以即便跑胶看不到也可以转化。我做的时候确实看不到，而引物二聚体却很明显，转化后确实长了单克隆，但都提不出质粒来。。。很困惑啊~ 2012-05-24 14:35:48
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-24 13:55:54
loveskyzhou: 金币+1, 对对，就是这个问题~ 有人说P出来的带可能会很浅 所以即便跑胶看不到也可以转化。我做的时候确实看不到，而引物二聚体却很明显，转化后确实长了单克隆，但都提不出质粒来。。。很困惑啊~ 2012-05-24 14:35:48
|
小猫回答的虽然对，但不是楼主问的问题。 楼主要做的是一步的点突变。用两条完全互补的引物将整个质粒pcr扩增出来。扩增得到的缺刻质粒转化至带有基因修复功能的dam+型细菌中，修复成完整的质粒。 楼主你放心做吧，没有问题的。我所做的成功率都非常高。你说的引物二聚体问题也有人做过改进 参考文献 L Zheng, U Baumann, and JL Reymond. An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol. Nucl. Acids Res., 32:e115, 2004. 但一般情况下，常规方法都能满足。 |
5楼2012-05-24 13:54:28
2楼2012-05-23 15:29:12
6楼2012-05-24 21:19:06
7楼2012-05-24 23:02:11
8楼2012-05-25 08:29:10
9楼2014-06-13 15:26:56
10楼2015-06-20 17:40:09
11楼2015-07-19 15:54:20
12楼2016-03-18 16:21:49