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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】两条序列只有1-2个变异位点，能设计特异引物区别出来吗？
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hexf

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】两条序列只有1-2个变异位点，能设计特异引物区别出来吗？

RT

[ Last edited by 1949stone on 2011-4-2 at 10:54 ]
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1楼2011-04-01 23:00:23
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
hexf(金币+1): 同求同求 2011-04-02 09:08:08
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-04-02 10:54:54
我试过用PCR鉴定一个单个碱基突变的基因，效果不好，对照和突变体都能扩增出来……
顶一顶
求高人解答，呵呵~
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2楼2011-04-01 23:39:49
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shaquila

金虫 (正式写手)
★
hexf(金币+1): 酶切位点的方法已用过，所以想用PCR来分 2011-04-02 09:08:56
1949stone(金币+1): 是个办法 2011-04-02 10:55:06
楼主可以试试有没有酶切位点识别這个序列
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3楼2011-04-02 08:37:07
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
hexf(金币+3): 2011-04-02 09:07:42
1949stone(金币+2): 最好分开调 2011-04-02 10:55:28
如果要设计引物，要保证一条引物的三端在这个碱基上，引物要短，降低镁离子浓度，试试最高的退火温度
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4楼2011-04-02 08:40:06
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susizheng

木虫 (著名写手)
hexf(金币+1): 样品量太大了，没那个钱一个一个测通，所以想此下策 2011-04-02 10:39:34
序列多长？测通不就搞定了。
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5楼2011-04-02 09:46:52
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hexf

木虫 (正式写手)
1949stone: 为什么说没有特异性？你要看扩出的结果 低温当然可以扩出来 2011-04-03 15:50:03
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-04-02 08:40:06:
如果要设计引物，要保证一条引物的三端在这个碱基上，引物要短，降低镁离子浓度，试试最高的退火温度

设计了引物回来，将突变的位点在3'的第一个位点，试过用温度梯度PCR检测退火温度，发现从48-60度都能扩增出条带，并且两个样品都能扩增出来。所以没有特异性
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6楼2011-04-02 10:03:23
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-04-02 12:26:25
楼主退火最高才60啊，试试65以上吧～～
或者把你引物序列发上来看看
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7楼2011-04-02 10:23:51
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hexf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-04-02 10:23:51:
楼主退火最高才60啊，试试65以上吧～～
或者把你引物序列发上来看看

我把序列发上来吧
Genbank上的号：DQ821670 ， DQ821671， DQ821672共三条序列，设计特异引物做M-PCR来区分这三个东西。
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8楼2011-04-02 10:31:31
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yj-lzx

荣誉版主 (文坛精英)
★
1949stone(金币+1, EPI+1): 专业 2011-04-02 10:58:58
给你个文献~~~可以鉴别单个碱基突变的~~~
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9楼2011-04-02 10:50:38
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)
hexf(金币+1): 版版进来了，马上给个红包（旁人请回避，我可不想公开行贿） 2011-04-02 14:42:33
引用回帖:
Originally posted by yj-lzx at 2011-04-02 10:50:38:
给你个文献~~~可以鉴别单个碱基突变的~~~

开始搞专业的了
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10楼2011-04-02 12:26:45
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yj-lzx

荣誉版主 (文坛精英)
★ ★ ★
hexf(金币+2): 你们太给力了，先给BB再看文献！ 2011-04-02 14:38:34
1949stone(金币+3): 连续鼓励 2011-04-02 20:49:12
给楼主个英文的~~~
http://g.zhubajie.com/urllink.php?id=10923033x8pnw2ujpt29tbpb
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12楼2011-04-02 12:48:41
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shaquila

金虫 (正式写手)
很好啊，专业搞genotyping的～
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13楼2011-04-02 14:09:06
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hexf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-04-02 14:09:06:
很好啊，专业搞genotyping的～

上来报告
退火温度到了65度，果然有些出来有些不出来了，初步结果还比较满意，但是明天还要多做一个M-PCR，希望结果能稳定。
谢谢shaquila
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14楼2011-04-03 00:14:44
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小燕子包谷

金虫 (正式写手)
★
hexf(金币+1):谢谢参与
顶一个
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15楼2011-04-03 01:01:18
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
hexf(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+3): good 2011-04-04 08:29:48
做HRM，单碱基的话480和rotor-gene可区分~~~两个的话7500之类的也可以了。虽然7500做单碱基或许也可以~
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16楼2011-04-03 15:41:14
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2, EPI+1): 综合本贴所有答案，鼓励交流 2011-04-04 08:31:33
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-04-03 15:41:14:
做HRM，单碱基的话480和rotor-gene可区分~~~两个的话7500之类的也可以了。虽然7500做单碱基或许也可以~

HRM很好娃，但是楼主貌似没有这设备和方案～～～
如果知道突变位点，用一些比较原始的方法应该也凑合，呵呵
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17楼2011-04-03 16:13:40
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shaquila

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hexf at 2011-04-03 00:14:44:
上来报告
退火温度到了65度，果然有些出来有些不出来了，初步结果还比较满意，但是明天还要多做一个M-PCR，希望结果能稳定。
谢谢shaquila

是呀是呀，类似的实验我有试过，退火临界值是可以初步区分出变异序列的～～
不过条件还是要摸索下，65也许不是最好的，可以在试试这个范围，结果可能可以更清楚
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18楼2011-04-03 16:15:12
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dreaming0816

金虫 (著名写手)
★
hexf(金币+1):谢谢参与
可以通过Real-time检测点突变的奥，，，
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19楼2011-04-03 18:46:47
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hexf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-04-03 15:41:14:
做HRM，单碱基的话480和rotor-gene可区分~~~两个的话7500之类的也可以了。虽然7500做单碱基或许也可以~

啥叫HRM？
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20楼2011-04-03 23:45:20
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hexf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by dreaming0816 at 2011-04-03 18:46:47:
可以通过Real-time检测点突变的奥，，，

这个仪器正在买，还在路上，不知什么时候才能到实验室里。
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21楼2011-04-03 23:45:56
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-04-04 08:30:17
引用回帖:
Originally posted by hexf at 2011-04-03 23:45:20:
啥叫HRM？

高分辨率溶解曲线

High Resolution Melting-curve

你可以去查查相关文献
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22楼2011-04-03 23:47:27
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tangbohejin

木虫之王 (文学泰斗)
★
hexf(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-04-02 08:37:07:
楼主可以试试有没有酶切位点识别這个序列

顶----
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23楼2011-04-04 23:57:22
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jessica533

新虫 (小有名气)
★
hexf(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by yj-lzx at 2011-04-02 10:50:38:
给你个文献~~~可以鉴别单个碱基突变的~~~

谢谢分享 了解一下
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24楼2011-04-05 10:05:20
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yj-lzx11楼
2011-04-02 12:47   回复  
引用回帖:
Originally posted by dhd997 at 2011-04-02 12:26:45: 开始搞专业的了

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