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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 问问pet-28a克隆构建引物的问题
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castlered

木虫 (小有名气)

[求助] 问问pet-28a克隆构建引物的问题

如果设计带C端his的引物，是不是下游只能用NCoI这个酶切位点啊，XbaI和NcoI之间的RBS对C端his表达有影响么，需要保留它么？
附pet-28a图谱
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1楼 2012-04-17 09:21:32
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
castlered: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-04-17 13:36:39
rbs序列不要去除，可以设计引物时加上其他的酶切位点紧连上his序列即可，注意加上保护碱基，另外要注意碱基数量，别导致发生移码，以至于没法表达His
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2楼2012-04-17 10:28:26
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castlered

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 太极拳 at 2012-04-17 10:28:26:
rbs序列不要去除，可以设计引物时加上其他的酶切位点紧连上his序列即可，注意加上保护碱基，另外要注意碱基数量，别导致发生移码，以至于没法表达His

如果是N端his肯定要保留rbs，C端也要么？C端不是从C端开始表达的么，rbs都在终止密码子后面，有意义么？
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3楼2012-04-17 10:52:58
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
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amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流。 2012-04-17 19:49:21
引用回帖:
3楼: Originally posted by castlered at 2012-04-17 10:52:58:
如果是N端his肯定要保留rbs，C端也要么？C端不是从C端开始表达的么，rbs都在终止密码子后面，有意义么？

不对，RBS（核糖体附着位点）是紧跟启动子和操纵子的，在起始密码子ATG之前，怎么会跑到终止密码子后面呢？看质粒图谱方向反了吧。
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Thank-you，so-blue.
4楼2012-04-17 11:15:06
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
castlered: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-04-17 13:36:54
RBS ribosome binding sequence，是翻译时核糖体结合位点，需要保留，还有注意去掉要表达蛋白的终止子，建议用NcoI和XhoI注意后面的酶切位点选择，选择不好有可能出现移码。
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5楼2012-04-17 11:18:11
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castlered

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by susizheng at 2012-04-17 11:15:06:
不对，RBS（核糖体附着位点）是紧跟启动子和操纵子的，在起始密码子ATG之前，怎么会跑到终止密码子后面呢？看质粒图谱方向反了吧。

pet-28a质粒不是可以构建N端his和C端his么？N端当然是正常的了，rbs在2启动子之后，ATG之前。但是用C端his呢？
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6楼2012-04-17 11:18:32
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
castlered: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-04-17 13:37:02
引用回帖:
6楼: Originally posted by castlered at 2012-04-17 11:18:32:
pet-28a质粒不是可以构建N端his和C端his么？N端当然是正常的了，rbs在2启动子之后，ATG之前。但是用C端his呢？

C端his,肯定是在基因之后，C端的his想要表达，需要突变掉你基因的终止密码子，并且要保证后面碱基数目。
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Thank-you，so-blue.
7楼2012-04-17 11:26:13
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lxmouse84

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
amisking: 金币+3, 鼓励帮助解答，欢迎继续交流。 2012-04-17 19:49:30
看了这么多回复，感觉都没说全啊。pET28a上面两个His tag，第一个当然是表达N端带his用的，第二个是用来表达C端带his用的。你想表达C端带his的，怎么能扯到rbs序列那里。要是N端不想要多余的东西，直接用上游NcoI加下游XhoI好了，别忘了给你要表达的片段加上ATG起始密码子，要是全长，就不用在N端加ATG，但是末尾要去掉终止密码子。
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8楼2012-04-17 14:10:35
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nemo88

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
9楼2012-04-17 15:18:37
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dshlove

木虫 (正式写手)
其实我也是初学者，说点自己看法。希望能帮上忙啊。
pET28a的MCS中不是有两个His tag，你要是C端的his和前面的rbs有什么关系？反正是ATG起始表达加上酶切位点加上tag再TGA结束不久可以了。
引物设计上游就从atg往rbs方向反向互补选21个左右碱基，加上你的蛋白中选21个左右的同源序列。下游同理。
顺便说一下，我用pET28a做共转化，一直是P出来的载体很差，假阳性占据大多。
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10楼2012-04-17 16:05:28
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