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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 问问pet-28a克隆构建引物的问题
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castlered

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lxmouse84 at 2012-04-17 14:10:35:
看了这么多回复，感觉都没说全啊。pET28a上面两个His tag，第一个当然是表达N端带his用的，第二个是用来表达C端带his用的。你想表达C端带his的，怎么能扯到rbs序列那里。要是N端不想要多余的东西，直接用上游NcoI ...

扯到rbs是因为我的序列里有NcoI这个酶切位点，纠结了下能不能用XbaI，然后脑子短路了下。。。去掉终止密码子这些我是知道的。
目前讨论的结果应该是rbs是需要的，也就是说如果我的片段里有NcoI酶切位点的话，就不能设计C端His了，是吧
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11楼2012-04-18 08:45:46
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lxmouse84

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by castlered at 2012-04-18 08:45:46:
扯到rbs是因为我的序列里有NcoI这个酶切位点，纠结了下能不能用XbaI，然后脑子短路了下。。。去掉终止密码子这些我是知道的。
目前讨论的结果应该是rbs是需要的，也就是说如果我的片段里有NcoI酶切位点的话，就 ...

如果你确定必须这么做也是可以的。
需要用点特别的方法，“双引物法”。这种方法不用管你所要表达的基因里面是否含有克隆所需的酶切位点。还有种方法是lic克隆方法。不过那种是用lic相关质粒。这两种方法是ligation free的。
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12楼2012-04-18 09:30:20
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by castlered at 2012-04-18 08:45:46:
扯到rbs是因为我的序列里有NcoI这个酶切位点，纠结了下能不能用XbaI，然后脑子短路了下。。。去掉终止密码子这些我是知道的。
目前讨论的结果应该是rbs是需要的，也就是说如果我的片段里有NcoI酶切位点的话，就 ...

可以啊！因为载体本身就有两个His选择啊。
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13楼2012-04-18 11:24:28
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