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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 问问pet-28a克隆构建引物的问题
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castlered

木虫 (小有名气)

[求助] 问问pet-28a克隆构建引物的问题

如果设计带C端his的引物，是不是下游只能用NCoI这个酶切位点啊，XbaI和NcoI之间的RBS对C端his表达有影响么，需要保留它么？
附pet-28a图谱
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1楼 2012-04-17 09:21:32
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castlered

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lxmouse84 at 2012-04-17 14:10:35:
看了这么多回复，感觉都没说全啊。pET28a上面两个His tag，第一个当然是表达N端带his用的，第二个是用来表达C端带his用的。你想表达C端带his的，怎么能扯到rbs序列那里。要是N端不想要多余的东西，直接用上游NcoI ...

扯到rbs是因为我的序列里有NcoI这个酶切位点，纠结了下能不能用XbaI，然后脑子短路了下。。。去掉终止密码子这些我是知道的。
目前讨论的结果应该是rbs是需要的，也就是说如果我的片段里有NcoI酶切位点的话，就不能设计C端His了，是吧
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11楼2012-04-18 08:45:46
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
castlered: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-04-17 13:36:39
rbs序列不要去除，可以设计引物时加上其他的酶切位点紧连上his序列即可，注意加上保护碱基，另外要注意碱基数量，别导致发生移码，以至于没法表达His
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2楼2012-04-17 10:28:26
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castlered

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 太极拳 at 2012-04-17 10:28:26:
rbs序列不要去除，可以设计引物时加上其他的酶切位点紧连上his序列即可，注意加上保护碱基，另外要注意碱基数量，别导致发生移码，以至于没法表达His

如果是N端his肯定要保留rbs，C端也要么？C端不是从C端开始表达的么，rbs都在终止密码子后面，有意义么？
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3楼2012-04-17 10:52:58
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流。 2012-04-17 19:49:21
引用回帖:
3楼: Originally posted by castlered at 2012-04-17 10:52:58:
如果是N端his肯定要保留rbs，C端也要么？C端不是从C端开始表达的么，rbs都在终止密码子后面，有意义么？

不对，RBS（核糖体附着位点）是紧跟启动子和操纵子的，在起始密码子ATG之前，怎么会跑到终止密码子后面呢？看质粒图谱方向反了吧。
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Thank-you，so-blue.
4楼2012-04-17 11:15:06
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