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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 问问pet-28a克隆构建引物的问题
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castlered

木虫 (小有名气)

[求助] 问问pet-28a克隆构建引物的问题

如果设计带C端his的引物，是不是下游只能用NCoI这个酶切位点啊，XbaI和NcoI之间的RBS对C端his表达有影响么，需要保留它么？
附pet-28a图谱
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1楼 2012-04-17 09:21:32
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lxmouse84

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by castlered at 2012-04-18 08:45:46:
扯到rbs是因为我的序列里有NcoI这个酶切位点，纠结了下能不能用XbaI，然后脑子短路了下。。。去掉终止密码子这些我是知道的。
目前讨论的结果应该是rbs是需要的，也就是说如果我的片段里有NcoI酶切位点的话，就 ...

如果你确定必须这么做也是可以的。
需要用点特别的方法，“双引物法”。这种方法不用管你所要表达的基因里面是否含有克隆所需的酶切位点。还有种方法是lic克隆方法。不过那种是用lic相关质粒。这两种方法是ligation free的。
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12楼2012-04-18 09:30:20
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
castlered: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-04-17 13:36:39
rbs序列不要去除，可以设计引物时加上其他的酶切位点紧连上his序列即可，注意加上保护碱基，另外要注意碱基数量，别导致发生移码，以至于没法表达His
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2楼2012-04-17 10:28:26
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castlered

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 太极拳 at 2012-04-17 10:28:26:
rbs序列不要去除，可以设计引物时加上其他的酶切位点紧连上his序列即可，注意加上保护碱基，另外要注意碱基数量，别导致发生移码，以至于没法表达His

如果是N端his肯定要保留rbs，C端也要么？C端不是从C端开始表达的么，rbs都在终止密码子后面，有意义么？
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3楼2012-04-17 10:52:58
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流。 2012-04-17 19:49:21
引用回帖:
3楼: Originally posted by castlered at 2012-04-17 10:52:58:
如果是N端his肯定要保留rbs，C端也要么？C端不是从C端开始表达的么，rbs都在终止密码子后面，有意义么？

不对，RBS（核糖体附着位点）是紧跟启动子和操纵子的，在起始密码子ATG之前，怎么会跑到终止密码子后面呢？看质粒图谱方向反了吧。
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Thank-you，so-blue.
4楼2012-04-17 11:15:06
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