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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物酶切位点问题
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Leo_xin

金虫 (小有名气)
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10楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-04-05 14:21:31
谢谢您的指导！...

太客气了。还指导呢。。。。
相互帮助而已嘛。别见外~
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还有太多地方值得改进。
11楼2013-04-05 16:32:31
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by Leo_xin at 2013-04-05 16:32:31
太客气了。还指导呢。。。。
相互帮助而已嘛。别见外~...

12楼2013-04-05 20:24:51
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紫藤玲珑

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by Leo_xin at 2013-04-02 01:11:36
如果你只为了做TA克隆，菌检送测 得到目的序列 而不要后续操作就没必要引入酶切位点，你PCR产物（Taq酶扩 直接有A）跟pMD18-T直接连便可。
如后需要后续实验的 就得加上酶切位点，可以从原来的引物上加，或者重新设 ...

我设计了两对引物，本来分数都挺高的
可是，引入酶切位点后都形成了发卡结构。酶切位点的选择很有限啊
可以在引物上不设计酶切位点，先连接到T载体上，再选择T载体上的酶切位点进行酶切吗？（如果此酶切位点表达载体上也存在的话）
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13楼2013-04-08 19:19:57
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紫藤玲珑

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by dulei at 2013-04-01 15:13:14
连接到一般的TA载体就行。你看看后来要用什么酶切位点，找一个带有所需酶切位点的TA载体。
你可用全式金的TA载体。pEASY-T1或pEASY-T3都行，上边有很多酶切位点，看看适合不适合下游操作。

你好，我设计的引物本来评分还可以。
可是加上酶切位点后，形成发卡结构、二聚体
我看好多文章都在引物上设计酶切位点，再连到T载体，为什么啊？
我可以不在引物上设计酶切位点，使用T载体上的酶切位点吗？
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14楼2013-04-08 20:37:05
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dulei

木虫 (小有名气)
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14楼: Originally posted by 紫藤玲珑 at 2013-04-08 20:37:05
你好，我设计的引物本来评分还可以。
可是加上酶切位点后，形成发卡结构、二聚体
我看好多文章都在引物上设计酶切位点，再连到T载体，为什么啊？
我可以不在引物上设计酶切位点，使用T载体上的酶切位点吗？...

只要不加酶切位点时上下游引物的长度和GC含量差不多就可以。最好不要有错配，尤其是3‘端。发卡结构和二聚体影响不大（看看ΔG值，绝对值不要太大，一般10以下都能接受）。

加上酶切位点后，可以不考虑错配、发卡结构以及二聚体（根据经验，ΔG值的绝对值不会很高）。只要考虑引物长度和GC含量，以为这两个因素影响TM值。

在引物上设计酶切位点再往T载体上连那是因为T载体上没有想要的酶切位点，或者他们想测序看看PCR的片段是不是正确的。

完全可以不设计酶切位点，直接连到T载体上，用T载体上的酶切位点。

如果你后续还要连到其他载体（比如做表达），那我建议不要往T载体上连，你可以在引物上设计酶切位点并设计保护碱基，这样PCR后，可以直接酶切往相应载体上连。省时省力省钱。不用非得往T载体上连，做一次TA克隆比较贵，往T载体上连一般都是为了测序。
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15楼2013-04-09 11:22:49
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Leo_xin

金虫 (小有名气)
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13楼: Originally posted by 紫藤玲珑 at 2013-04-08 19:19:57
我设计了两对引物，本来分数都挺高的
可是，引入酶切位点后都形成了发卡结构。酶切位点的选择很有限啊
可以在引物上不设计酶切位点，先连接到T载体上，再选择T载体上的酶切位点进行酶切吗？（如果此酶切位点表达 ...

可以的，现在的T载体上都有MCS.
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16楼2013-04-09 13:50:58
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紫藤玲珑

新虫 (初入文坛)
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15楼: Originally posted by dulei at 2013-04-09 11:22:49
只要不加酶切位点时上下游引物的长度和GC含量差不多就可以。最好不要有错配，尤其是3‘端。发卡结构和二聚体影响不大（看看ΔG值，绝对值不要太大，一般10以下都能接受）。

加上酶切位点后，可以不考虑错配、发 ...

我看premier5上面的我的△G基本都是-30多，
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17楼2013-04-09 19:19:09
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紫藤玲珑

新虫 (初入文坛)
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15楼: Originally posted by dulei at 2013-04-09 11:22:49
只要不加酶切位点时上下游引物的长度和GC含量差不多就可以。最好不要有错配，尤其是3‘端。发卡结构和二聚体影响不大（看看ΔG值，绝对值不要太大，一般10以下都能接受）。

加上酶切位点后，可以不考虑错配、发 ...

就是这个引物

00.jpg
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18楼2013-04-09 19:33:12
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紫藤玲珑

新虫 (初入文坛)
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15楼: Originally posted by dulei at 2013-04-09 11:22:49
只要不加酶切位点时上下游引物的长度和GC含量差不多就可以。最好不要有错配，尤其是3‘端。发卡结构和二聚体影响不大（看看ΔG值，绝对值不要太大，一般10以下都能接受）。

加上酶切位点后，可以不考虑错配、发 ...

非常感谢
还有个问题
下图里，加酶切位点后发卡结构的△G是0.2，二聚体是-6.8，但是错配是-40.8，

122.jpg
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19楼2013-04-09 20:11:49
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
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16楼: Originally posted by Leo_xin at 2013-04-09 13:50:58
可以的，现在的T载体上都有MCS....

你好！照这么说，是不是可以将目的片段连接到与表达载体有相应酶切位点的T载体中？而且要保证T载体的两个酶切位点在表达载体中各只存在一个，且位置不能太远，而且我的目的片段里没有相关的酶切位点，是这样吧？这样一来，我可以不用在做表达的时候，重新设计添加双酶切位点的引物了，省了这一步了？

还有，我挺想知道加酶切位点的保护碱基是不是随意加就行的，一般2~3个就行，选择哪个碱基是看整体引物的碱基分布情况，比如整条引物GC含量高，可以选择A、T作为保护碱基，反之加G\C为保护碱基？


在线等待您的回答~
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思路决定出路。。。
20楼2013-04-10 09:54:36
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