24小时热门版块排行榜    

查看: 2736  |  回复: 23
本帖产生 1 个 MolEPI ,点击这里进行查看

Leo_xin

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-04-05 14:21:31
谢谢您的指导!...

太客气了。还指导呢。。。。
相互帮助而已嘛。别见外~
还有太多地方值得改进。
11楼2013-04-05 16:32:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lmcyjxs

金虫 (正式写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by Leo_xin at 2013-04-05 16:32:31
太客气了。还指导呢。。。。
相互帮助而已嘛。别见外~...

12楼2013-04-05 20:24:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

紫藤玲珑

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by Leo_xin at 2013-04-02 01:11:36
如果你只为了做TA克隆,菌检送测 得到目的序列 而不要后续操作就没必要引入酶切位点,你PCR产物(Taq酶扩 直接有A)跟pMD18-T直接连便可。
如后需要后续实验的 就得加上酶切位点,可以从原来的引物上加,或者重新设 ...

我设计了两对引物,本来分数都挺高的
可是,引入酶切位点后都形成了发卡结构。酶切位点的选择很有限啊
可以在引物上不设计酶切位点,先连接到T载体上,再选择T载体上的酶切位点进行酶切吗?(如果此酶切位点表达载体上也存在的话)
13楼2013-04-08 19:19:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

紫藤玲珑

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by dulei at 2013-04-01 15:13:14
连接到一般的TA载体就行。你看看后来要用什么酶切位点,找一个带有所需酶切位点的TA载体。
你可用全式金的TA载体。pEASY-T1或pEASY-T3都行,上边有很多酶切位点,看看适合不适合下游操作。

你好,我设计的引物本来评分还可以。
可是加上酶切位点后,形成发卡结构、二聚体
我看好多文章都在引物上设计酶切位点,再连到T载体,为什么啊?
我可以不在引物上设计酶切位点,使用T载体上的酶切位点吗?
14楼2013-04-08 20:37:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dulei

木虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by 紫藤玲珑 at 2013-04-08 20:37:05
你好,我设计的引物本来评分还可以。
可是加上酶切位点后,形成发卡结构、二聚体
我看好多文章都在引物上设计酶切位点,再连到T载体,为什么啊?
我可以不在引物上设计酶切位点,使用T载体上的酶切位点吗?...

只要不加酶切位点时上下游引物的长度和GC含量差不多就可以。最好不要有错配,尤其是3‘端。发卡结构和二聚体影响不大(看看ΔG值,绝对值不要太大,一般10以下都能接受)。

加上酶切位点后,可以不考虑错配、发卡结构以及二聚体(根据经验,ΔG值的绝对值不会很高)。只要考虑引物长度和GC含量,以为这两个因素影响TM值。

在引物上设计酶切位点再往T载体上连那是因为T载体上没有想要的酶切位点,或者他们想测序看看PCR的片段是不是正确的。

完全可以不设计酶切位点,直接连到T载体上,用T载体上的酶切位点。

如果你后续还要连到其他载体(比如做表达),那我建议不要往T载体上连,你可以在引物上设计酶切位点并设计保护碱基,这样PCR后,可以直接酶切往相应载体上连。省时省力省钱。不用非得往T载体上连,做一次TA克隆比较贵,往T载体上连一般都是为了测序。
15楼2013-04-09 11:22:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Leo_xin

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by 紫藤玲珑 at 2013-04-08 19:19:57
我设计了两对引物,本来分数都挺高的
可是,引入酶切位点后都形成了发卡结构。酶切位点的选择很有限啊
可以在引物上不设计酶切位点,先连接到T载体上,再选择T载体上的酶切位点进行酶切吗?(如果此酶切位点表达 ...

可以的,现在的T载体上都有MCS.
还有太多地方值得改进。
16楼2013-04-09 13:50:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

紫藤玲珑

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
15楼: Originally posted by dulei at 2013-04-09 11:22:49
只要不加酶切位点时上下游引物的长度和GC含量差不多就可以。最好不要有错配,尤其是3‘端。发卡结构和二聚体影响不大(看看ΔG值,绝对值不要太大,一般10以下都能接受)。

加上酶切位点后,可以不考虑错配、发 ...

我看premier5上面的我的△G基本都是-30多,
17楼2013-04-09 19:19:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

紫藤玲珑

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
15楼: Originally posted by dulei at 2013-04-09 11:22:49
只要不加酶切位点时上下游引物的长度和GC含量差不多就可以。最好不要有错配,尤其是3‘端。发卡结构和二聚体影响不大(看看ΔG值,绝对值不要太大,一般10以下都能接受)。

加上酶切位点后,可以不考虑错配、发 ...

就是这个引物

00.jpg

18楼2013-04-09 19:33:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

紫藤玲珑

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
15楼: Originally posted by dulei at 2013-04-09 11:22:49
只要不加酶切位点时上下游引物的长度和GC含量差不多就可以。最好不要有错配,尤其是3‘端。发卡结构和二聚体影响不大(看看ΔG值,绝对值不要太大,一般10以下都能接受)。

加上酶切位点后,可以不考虑错配、发 ...

非常感谢
还有个问题
下图里,加酶切位点后发卡结构的△G是0.2,二聚体是-6.8,但是错配是-40.8,

122.jpg

19楼2013-04-09 20:11:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lmcyjxs

金虫 (正式写手)

引用回帖:
16楼: Originally posted by Leo_xin at 2013-04-09 13:50:58
可以的,现在的T载体上都有MCS....

你好!照这么说,是不是可以将目的片段连接到与表达载体有相应酶切位点的T载体中?而且要保证T载体的两个酶切位点在表达载体中各只存在一个,且位置不能太远,而且我的目的片段里没有相关的酶切位点,是这样吧?这样一来,我可以不用在做表达的时候,重新设计添加双酶切位点的引物了,省了这一步了?

还有,我挺想知道加酶切位点的保护碱基是不是随意加就行的,一般2~3个就行,选择哪个碱基是看整体引物的碱基分布情况,比如整条引物GC含量高,可以选择A、T作为保护碱基,反之加G\C为保护碱基?


在线等待您的回答~
思路决定出路。。。
20楼2013-04-10 09:54:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lmcyjxs 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
信息提示
请填处理意见