24小时热门版块排行榜

>论坛更新日志 (5076)
>文献求助 (385)
>论文投稿 (350)
>导师招生 (338)
>博后之家 (267)
>虫友互识 (254)
>考博 (127)
>硕博家园 (112)
>学术会议 (108)
>有机交流 (91)
>招聘信息布告栏 (86)
>基金申请 (48)
>休闲灌水 (39)
>教师之家 (35)
>考研 (31)
>找工作 (29)

返回列表

本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

lmcyjxs

金虫 (正式写手)

MolEPI: 1
应助: 17 (小学生)
金币: 1088.2
散金: 119
红花: 7
帖子: 954
在线: 124.3小时
虫号: 1255578
注册: 2011-04-05
性别: MM
专业: 中药资源

[交流] 引物酶切位点问题已有6人参与

大家好，我要做克隆表达，但是设计的引物没有加酶切位点，做TA克隆的话会不会比较麻烦？有没有比较好的方法改进啊？一般克隆载体大家用什么载体啊？还有表达载体大家又用什么呢？

回复此楼

» 猜你喜欢

AM630（CAS 164178-33-0）：CB2 选择性配体的实验使用与供应要点已经有0人回复
ADC标杆分子T-DM1全解析：从结构设计到实验室应用的技术要点已经有0人回复
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费? 已经有102人回复
HILIC磁珠研究蛋白组学怎么做？已经有0人回复
His标签蛋白纯化怎么才能快？已经有0人回复
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析已经有0人回复
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用已经有0人回复
SHP2 变构抑制剂 Sitneprotafib：从作用机制到科研试剂选型要点已经有0人回复
PRMT5·MTA 抑制剂 MRTX1719 的科研应用已经有0人回复
SW033291 科研使用解析：分子特征、储存与实验获取要点已经有0人回复
泛 RAS 抑制新思路：大环肽拟似物如何同时牵住突变型与野生型 RAS？已经有0人回复

思路决定出路。。。

1楼 2013-04-01 14:11:45

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

dulei

木虫 (小有名气)

MolEPI: 1
应助: 8 (幼儿园)
金币: 1426.9
散金: 1261
红花: 2
帖子: 209
在线: 74.5小时
虫号: 593568
注册: 2008-09-05
性别: GG
专业: 生物化学

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

引用回帖:

14楼: Originally posted by 紫藤玲珑 at 2013-04-08 20:37:05
你好，我设计的引物本来评分还可以。
可是加上酶切位点后，形成发卡结构、二聚体
我看好多文章都在引物上设计酶切位点，再连到T载体，为什么啊？
我可以不在引物上设计酶切位点，使用T载体上的酶切位点吗？...

只要不加酶切位点时上下游引物的长度和GC含量差不多就可以。最好不要有错配，尤其是3‘端。发卡结构和二聚体影响不大（看看ΔG值，绝对值不要太大，一般10以下都能接受）。

加上酶切位点后，可以不考虑错配、发卡结构以及二聚体（根据经验，ΔG值的绝对值不会很高）。只要考虑引物长度和GC含量，以为这两个因素影响TM值。

在引物上设计酶切位点再往T载体上连那是因为T载体上没有想要的酶切位点，或者他们想测序看看PCR的片段是不是正确的。

完全可以不设计酶切位点，直接连到T载体上，用T载体上的酶切位点。

如果你后续还要连到其他载体（比如做表达），那我建议不要往T载体上连，你可以在引物上设计酶切位点并设计保护碱基，这样PCR后，可以直接酶切往相应载体上连。省时省力省钱。不用非得往T载体上连，做一次TA克隆比较贵，往T载体上连一般都是为了测序。