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yujiaping1木虫 (著名写手)
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[交流]
【专题】引入酶切位点的引物设计问题
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为了跑原核表达设计5‘端加酶切位点的引物 原始引物根据pcr引物设计基本原则设计好了 在加酶切位点的时候烦心了 因为引物要加Not I酶切位点结果引入了8个GC 造成总引物GC含量超过72%，为了配平GC含量于是引进若干TA结果又造成这个引物过长 引物总退火温度升到80多。 我知道引物设计时退火温度是不考虑5’端附加序列的，但是前几个循环之后这些附加是作为引物匹配序列存在的，不能完全无视之吧？ 为了防止新的错配出现（前几个循环之后）是否要相应的提高一下退火温度呢？ 但是似乎在几个循环之后，带有引物序列的模板已经成为优势模板，似乎退火温度又对它影响不大。。。 真是斩不断理还乱 我是刚刚接触这方面，关于5‘端修饰的pcr引物设计及PCR条件设定，能否请行家指点一二 ？ |
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