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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【专题】引入酶切位点的引物设计问题
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
yujiaping1(金币+1): 2010-09-14 11:26:22
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-09-14 10:41:22:

我原来的想法是Ta克隆后酶切 这样还可以方便的测序以验证序列，所以没加保护碱基，配平GC含量真的这么重要么？

也不需要那么严格吧，我有时候引物Tm七八十度，用六十多度一样可以扩增得很好啊。
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Thank-you，so-blue.
11楼2010-09-14 10:47:04
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lihengyang86

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1楼: Originally posted by yujiaping1 at 2010-09-13 21:44:28:
为了跑原核表达设计5‘端加酶切位点的引物
原始引物根据pcr引物设计基本原则设计好了
在加酶切位点的时候烦心了
因为引物要加Not I酶切位点结果引入了8个GC
造成总引物GC含量超过72%，为了配平GC含量于是引进 ...

您好！我最近设计引入酶切位点的引物，也遇到您说的情况，引入酶切位点和保护性碱基后 总引物GC含量很高（75%以上），Tm值更是达到了80度以上。
您提到像这种情况可不用考虑5‘端的修饰来计算引物的Tm值，这个在PCR的实际操作中可行吗？
另外，你后面考虑的问题，最终你在PCR的过程中是如何解决或优化的呢？
谢谢！期待您的指点！！！
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12楼2012-02-29 16:35:18
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