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jingyi_180银虫 (正式写手)
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[求助]
功能基因扩增相关
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跨专业做这个太难了，所以必须来小木虫求助了。 问题1：提取纯菌和环境样品中的总DNA后的下一步是不是必须进行DNA纯化？我的目的是扩增功能基因。 问题2：怎么样寻找或者是判断你获得的功能基因序列是完整的？ 问题3：我注意到目前很多研究功能基因序列的都是不完整的，如果要研究蛋白表达是不是一定要完整序列才行？还有为什么只要扩增到功能基因的片段序列就可以说明这个菌种具有这个功能？ 以上问题google也找不到，所以希望热心的虫子们帮我解答一下。 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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cheng_xiao
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1. 这个不一定，你可以不用纯化，只要你能够扩增出来就行 2. 一般完整的功能序列有起始密码子和终止密码子，由于你是从DNA中扩增，所以可能存在内含子，如果是这样，你可以比对进一步确定。 3. 对，表达一般是需要完整序列的。 是这样的，菌的基因较少，所含的无功能基因基本没有，所以只要你确定这个基因在了，基本上就确定它行驶功能。 说的不全，多多包涵，实验顺利 |
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jingyi_180
2楼2012-04-25 14:25:35
天使托
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T.Shen
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【答案】应助回帖
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问题1：提取纯菌和环境样品中的总DNA后的下一步是不是必须进行DNA纯化？我的目的是扩增功能基因。 答：肯定是要纯化的，不然会影响你后期的扩增！ 问题2：怎么样寻找或者是判断你获得的功能基因序列是完整的？ 答：测序或者NCBI查询！ 问题3：我注意到目前很多研究功能基因序列的都是不完整的，如果要研究蛋白表达是不是一定要完整序列才行？还有为什么只要扩增到功能基因的片段序列就可以说明这个菌种具有这个功能？ 答：肯定必须是完整的序列。。。还有为什么只要扩增到功能基因的片段序列就可以说明这个菌种具有这个功能？这句话我不是很理解！你必须去研究这段序列所具有的功能才知道此菌是否有此功能吧？ |
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6楼2012-04-25 18:58:25
ctt1984
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真难为你了，一是好好哈看看文献，再者多请教一下别人吧。最好找一个分子生物学还凑合的人来指导一下，否则以你现在的基础很难做出东西来。 1， 问题1：提取纯菌和环境样品中的总DNA后的下一步是不是必须进行DNA纯化？我的目的是扩增功能基因。 提取纯菌和环境样品中的总DNA一般来说经酚/氯仿抽提和酒精洗涤就够用了，没必要再去纯化。当然，你去纯化的话效果更好。但就我经验来看，真的没必要，毕竟我们只是拿它来作为模板扩增我们需要的目的片段。 2，问题2：怎么样寻找或者是判断你获得的功能基因序列是完整的？ 当你扩增完你的序列之后肯定要拿去测序，测序后在数据库如NCBI上比较就好。一般来说你的功能基因NCBI上都有专门的序列，所以你比较那些直接与你相关的功能基因就好，没必要去查某个细菌的全基因序列，免得把自己搞乱了。其实，这一步在你设计引物的时候就应该确定好了，因为只有知道自己需要什么才能有目的去找自己需要的那一段，但是我估计你可能直接从文献把别人引物拿来用，那样的话更简单，直接扩条带，之后测序鉴定有没有出现碱基不对应，如果全部正确，那么恭喜你了。 问题3：我注意到目前很多研究功能基因序列的都是不完整的，如果要研究蛋白表达是不是一定要完整序列才行？还有为什么只要扩增到功能基因的片段序列就可以说明这个菌种具有这个功能？ 要完正表达一个蛋白，序列必须是完整的，因此你首先要确定表达这个蛋白所有的碱基是否全部包含了。至于扩增到功能基因片段才能说明问题，这是因为蛋白是行使功能的单位，而核苷酸是编码蛋白的，因此只要你可以把所编码蛋白的核苷酸从你的细菌里面扩增出来，说明它具有合成这种蛋白的潜在能力，但是这个蛋白表达量如何，这个就只能通过一些蛋白纯化及鉴定，定量手段来评价，或者直接简单通过PCR来初步判断。 另外，细菌属于原核生物，没有内含子，所以不必担心这个问题；测序就是你把你扩增的基因片段送去公司，他会把你的序列解读出来，如果序列碱基分布和你需要的完全一致，那就说明你的是对的，如果不一样，那就说明你的是错的；只要一般文献中研究功能基因的话，假如功能基因全长是2000bp的话，一般只扩到其中的800bp，他们就说这个菌株具有这个功能，这种说法不全面，当然作为初步判断是可以的，照常理来说，最好是多设计几个引物，因为我们一般认为测序只有800多个碱基可以读通的，因此每800个碱基左右设计一个引物，之后把所有序列拼接起来就可以知道这20000BP的全部序列了。 建议你还是去找一个比较精通的师兄师姐帮忙，分子这东西很玄乎，只有彻底搞懂了才能做下去，否则你一个设计错误或者概念模糊就把自己坑死了。 总之祝福你吧！ |
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8楼2012-04-26 11:05:50
jingyi_180
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5楼2012-04-25 17:12:28
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7楼2012-04-25 19:50:43
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问题1：提取纯菌和环境样品中的总DNA后的下一步是不是必须进行DNA纯化？我的目的是扩增功能基因。 一般需要通过切胶回收克隆 不然PCR产物中的一些东西可能会对后续的功能分析有影响 最好是提质粒吧 问题2：怎么样寻找或者是判断你获得的功能基因序列是完整的？ NCBI查找相关信息 细菌就只用看DNA序列了 如果真核 就查mRNA序列 在启动子上游设计上游引物 终止子下游设计下游引物 这样可以扩增出完整的CDS 如果该物种基因组信息不全 可以通过EST拼接方法 得到完整的序列 然后设计引物 实在不全 查找同源性较高的物种 用其他物种的序列设计引物 扩增你所需要的片段 最后不行的话 就用RACE了 问题3：我注意到目前很多研究功能基因序列的都是不完整的，如果要研究蛋白表达是不是一定要完整序列才行？还有为什么只要扩增到功能基因的片段序列就可以说明这个菌种具有这个功能？ 研究功能用的是编码区序列（CDS） 扩增出来之后可以通过多种手段去研究该蛋白功能 |
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9楼2012-04-26 14:38:56
jingyi_180
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