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waterworld

木虫 (正式写手)

[求助] 只知道基因CDS区序列，如何扩增该基因的启动子

如题，我想克隆山羊一个基因的启动子，CDS区已经由本实验室另外的师妹克隆出来，本来想克隆5‘RACE之后找到转录起始位点，再克隆启动子的，但是最近发现5'RACE试剂盒用完啦，那个试剂盒比较贵，再买一个的可能性不是很大。所以目前在这种情况下如何克隆该基因的启动子。
还有，山羊和牛的相似性很高，可以参考牛的基因组序列，查到NCBI中有牛的mRNA序列，但是只有部分5’RACE序列，不到100bp的样子。。。因为目前山羊的基因组还没有公布，我们克隆山羊的启动子一般都是根据牛的基因组序列设计，不知道在有这些信息的情况下怎么设计引物克隆？？？？求各位大神指教！！！
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Never grow old
1楼2013-06-16 21:34:20
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

niil

金虫 (正式写手)
克隆启动子的序列，用5‘ RACE是扩不出来的。
市面上有些genome walking的盒子，可以买着用用。如，宝生物的Genome Walking Kit，一千多块，10次，效果还可以的。
原理很简单，很容易上手，只是在根据CDS设计引物的时候避开外显子和内含子的边界区就可以了。
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Stop fighting,let it flow.
10楼2013-06-26 15:40:08
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普通回帖

137167741

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
waterworld: 金币+3 2013-06-17 09:58:49
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-17 13:57:50
第一、可以在比对后在保守区设计引物来扩增
第二、步移
希望可以帮到你，试验顺利~~
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总有一天我要修改用户名。
2楼2013-06-16 22:36:52
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hongyz

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
waterworld: 金币+3 2013-06-17 09:58:41
myprayer: Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-17 13:58:09
这篇文献应该可以解决你的问题： 长距离反向PCR技术高效扩增已知DNA片断的侧翼序列
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会选择，会放弃；会思想，会追求
3楼2013-06-17 00:16:26
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
waterworld: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-06-17 09:58:30
myprayer: Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-17 13:58:15
5’-RACE，基因组文库筛选出完整基因，反向PCR，染色体步移等。具体文献和Procotols，查分子克隆。

Molecular cloning--Laboratory manuals(2001)3rd edition（3 Volumes) Free
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5998393
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4楼2013-06-17 01:27:49
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waterworld

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 137167741 at 2013-06-16 22:36:52
第一、可以在比对后在保守区设计引物来扩增
第二、步移
希望可以帮到你，试验顺利~~

谢谢
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Never grow old
5楼2013-06-17 09:57:21
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waterworld

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hongyz at 2013-06-17 00:16:26
这篇文献应该可以解决你的问题： 长距离反向PCR技术高效扩增已知DNA片断的侧翼序列

谢谢，已经下载 了文献，好好研究一下。
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Never grow old
6楼2013-06-17 09:58:03
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andywang6137

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by waterworld at 2013-06-17 09:58:03
谢谢，已经下载 了文献，好好研究一下。...

MM弄明白了吗？明白了，出来说说
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7楼2013-06-18 13:42:54
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waterworld

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by andywang6137 at 2013-06-18 13:42:54
MM弄明白了吗？明白了，出来说说...

没有太明白，看来看去，越发糊涂了。
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Never grow old
8楼2013-06-18 14:40:03
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platanus

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
waterworld: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2013-06-18 16:34:26
如果已经拿到了CDS区的话，根据序列进行同源比对，初步确定内含子的位子，再根据序列设计特异引物，采用热不对称PCR扩增，这个方法扩增未知序列效率比较高，或者采用染色体步移法也可以！
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9楼2013-06-18 15:00:15
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