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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 扩增基因CDS区域如何设计引物？
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

[求助] 扩增基因CDS区域如何设计引物？

请问欲扩增基因CDS区域然后连接载体转染入细胞内表达，引物如何设计？我看到有人说上游引物在起始密码子前照抄20个左右，这是什么意思啊 ？
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1楼 2012-11-18 21:44:19
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-11-24 13:49:17
楼主这是最基础的东西你咋都不懂呢？？？
1、在NCBI上找到该基因的CDS区。
2、直接复制到premier里面（记住直接复制）。
3、设计引物。上游即是从第一个碱基开始数，17到24个bp都行；下游引物即是从最后一个开始配对的反向的碱基序列。注意尽量避免错配、引物二聚体。
4、引物设计好以后看一下上下游的Tm值是不是相差太多。两者的Tm值最好别超过5度。
5、引物设计好以后，在NCBI里面的premier-Blast里面Blast一下，看能不能Blast出你想要的目的基因。
6、加酶切位点和保护碱基。一般参考的保护碱基为以下链接。
http://www.dxy.cn/bbs/topic/2574 ... 4%E7%A2%B1%E5%9F%BA
祝好运！！！
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keepon
12楼2012-11-24 10:19:28
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普通回帖

yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
2楼2012-11-18 21:44:39
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
谁能帮帮我啊？愿意赠送金币
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3楼2012-11-18 21:45:18
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
照抄后又想输入到PRIMER 5中检验，那粘贴时直接粘呢？还是选择反过来呢？
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4楼2012-11-18 21:56:26
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
谁能帮帮我啊？？？？？？、、、、
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5楼2012-11-22 22:28:29
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lvanmorison

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
6楼2012-11-22 23:02:02
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lvanmorison at 2012-11-22 23:02:02
你是在基因组里面PCR，还是用mRNA来PCR啊？
应该是在基因的CDS序列的前后各设计一个引物，就好了吧。
我也在做这个呢

我是提取细胞总RNA然后用试剂盒反转录成cDNA，用cDNA作为模板扩增基因的CDS区，然后想要转染进细胞中，您说的“应该是在基因的CDS序列的前后各设计一个引物，就好了吧。”可以告诉我具体是怎么设计的吗？多谢啦，本人分子新手，急需帮助。  期待您的回复！
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7楼2012-11-23 18:48:19
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lvanmorison

禁虫 (初入文坛)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-24 13:48:50
本帖内容被屏蔽
8楼2012-11-23 21:00:01
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lvanmorison at 2012-11-23 21:00:01
比如MYOD1基因，我首先在NCBI找到它的mRNA序列，然后找到它的CDS序列，全部复制下来，在primer 5.0 中，正向引物直接从CDS的第一个核酸开始（比如18bp），反向引物从CDS最后一个核酸开始，向前选择序列（比如17bp） ...

酶切位点以及保护碱基是依据什么加上去的啊？
正向引物和反向引物的序列与mRNA的序列是一样的还是互补的呢？我是用mRNA反转录的cDNA作为模板进行PCR的。
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9楼2012-11-23 21:29:31
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lvanmorison at 2012-11-23 21:00:01
比如MYOD1基因，我首先在NCBI找到它的mRNA序列，然后找到它的CDS序列，全部复制下来，在primer 5.0 中，正向引物直接从CDS的第一个核酸开始（比如18bp），反向引物从CDS最后一个核酸开始，向前选择序列（比如17bp） ...

在NCBI找到mRNA序列，然后找到它的CDS序列，复制到primer 5.0 中时，是直接复制还是选择“互补”或者“反向互补”之类的其他选项？
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10楼2012-11-23 21:34:35
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