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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 扩增基因CDS区域如何设计引物？
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lvanmorison

禁虫 (初入文坛)
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11楼2012-11-24 07:46:54
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-11-24 13:49:17
楼主这是最基础的东西你咋都不懂呢？？？
1、在NCBI上找到该基因的CDS区。
2、直接复制到premier里面（记住直接复制）。
3、设计引物。上游即是从第一个碱基开始数，17到24个bp都行；下游引物即是从最后一个开始配对的反向的碱基序列。注意尽量避免错配、引物二聚体。
4、引物设计好以后看一下上下游的Tm值是不是相差太多。两者的Tm值最好别超过5度。
5、引物设计好以后，在NCBI里面的premier-Blast里面Blast一下，看能不能Blast出你想要的目的基因。
6、加酶切位点和保护碱基。一般参考的保护碱基为以下链接。
http://www.dxy.cn/bbs/topic/2574 ... 4%E7%A2%B1%E5%9F%BA
祝好运！！！
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keepon
12楼2012-11-24 10:19:28
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
12楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-11-24 10:19:28
楼主这是最基础的东西你咋都不懂呢？？？
1、在NCBI上找到该基因的CDS区。
2、直接复制到premier里面（记住直接复制）。
3、设计引物。上游即是从第一个碱基开始数，17到24个bp都行；下游引物即是从最后一个开始 ...

非常感谢！本人新手，望包涵！
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13楼2012-11-24 19:40:19
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
12楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-11-24 10:19:28
楼主这是最基础的东西你咋都不懂呢？？？
1、在NCBI上找到该基因的CDS区。
2、直接复制到premier里面（记住直接复制）。
3、设计引物。上游即是从第一个碱基开始数，17到24个bp都行；下游引物即是从最后一个开始 ...

1.   那我把CDS区直接复制粘贴到primer 5中，把铅笔形光标放到序列前端，自动匹配出的上游引物是与我粘贴的mRNA序列互补的啊，而不是与原始序列一致的序列啊？
2.   这样自动设计的下游引物倒是与原来粘贴的序列互补的
3.   这样设计出的1对上下游引物即可同时使用了吗？
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14楼2012-11-24 19:51:42
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by yuguiyan at 2012-11-24 19:51:42
1.   那我把CDS区直接复制粘贴到primer 5中，把铅笔形光标放到序列前端，自动匹配出的上游引物是与我粘贴的mRNA序列互补的啊，而不是与原始序列一致的序列啊？
2.   这样自动设计的下游引物倒是与原来粘贴的序列互 ...

对的啦。。。当你把光标放到序列前端时，自动匹配的是上游引物，而这段序列刚好就是你的CDS区的前17到24个碱基的序列，这个你可以自己观察一下。建议楼主看一下PCR的原理。
上游即使CDS区前17到25个碱基的序列；而下游引物即使与末端反向互补的一段序列。
设计出来的一对引物肯定是可以使用的啦。。。
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keepon
15楼2012-11-25 09:07:54
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
15楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-11-25 09:07:54
对的啦。。。当你把光标放到序列前端时，自动匹配的是上游引物，而这段序列刚好就是你的CDS区的前17到24个碱基的序列，这个你可以自己观察一下。建议楼主看一下PCR的原理。
上游即使CDS区前17到25个碱基的序列；而 ...

“把光标放到序列前端时，自动匹配的是上游引物，而这段序列刚好就是你的CDS区的前17到24个碱基的序列”，我观察到：这段序列与CDS区的前17到24个碱基的序列是互补的啊，不是一致的啊！跟您说的不一致啊
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16楼2012-11-25 15:59:50
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
12楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-11-24 10:19:28
楼主这是最基础的东西你咋都不懂呢？？？
1、在NCBI上找到该基因的CDS区。
2、直接复制到premier里面（记住直接复制）。
3、设计引物。上游即是从第一个碱基开始数，17到24个bp都行；下游引物即是从最后一个开始 ...

模板是找到基因的mRNA序列后点击FASTA格式的序列码？
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17楼2012-11-25 16:35:23
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lvanmorison at 2012-11-23 21:00:01
比如MYOD1基因，我首先在NCBI找到它的mRNA序列，然后找到它的CDS序列，全部复制下来，在primer 5.0 中，正向引物直接从CDS的第一个核酸开始（比如18bp），反向引物从CDS最后一个核酸开始，向前选择序列（比如17bp） ...

DNA是双链的，所谓上游引物和下游引物，是以其中一条链为基准说的，是不是以另外一条链为基准的话上游和下游的说法就要颠倒过来了呢？我提总RNA然后用试剂盒反转录成cDNA，用cDNA作为模板扩增基因的CDS区，那么我的模板到底是与mRNA序列相同还是互补呢？还是不必区分，反正两条链都要扩增出来！急求回答，多谢了
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18楼2012-11-25 16:56:53
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by yuguiyan at 2012-11-25 15:59:50
“把光标放到序列前端时，自动匹配的是上游引物，而这段序列刚好就是你的CDS区的前17到24个碱基的序列”，我观察到：这段序列与CDS区的前17到24个碱基的序列是互补的啊，不是一致的啊！跟您说的不一致啊...

哥们。。。你看一下PCR的原理就知道啦。。上游引物就是你的目的基因前面那17到25啦（不是互补）。下游引物即是与你的目的基因末端反向互补的序列啦。Genebank和FAST格式不都是一样的吗？哥们。。。你真的好好看一下PCR的原理。。。
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keepon
19楼2012-11-25 19:26:51
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
19楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-11-25 19:26:51
哥们。。。你看一下PCR的原理就知道啦。。上游引物就是你的目的基因前面那17到25啦（不是互补）。下游引物即是与你的目的基因末端反向互补的序列啦。Genebank和FAST格式不都是一样的吗？哥们。。。你真的好好看一下 ...

我直接粘贴序列但是primer5显示出的模板是我粘的序列的互补序列啊，呵呵，没有注意观察啊！
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20楼2012-11-25 22:01:57
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