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waterworld

木虫 (正式写手)

[求助] 只知道基因CDS区序列,如何扩增该基因的启动子

如题,我想克隆山羊一个基因的启动子,CDS区已经由本实验室另外的师妹克隆出来,本来想克隆5‘RACE之后找到转录起始位点,再克隆启动子的,但是最近发现5'RACE试剂盒用完啦,那个试剂盒比较贵,再买一个的可能性不是很大。所以目前在这种情况下如何克隆该基因的启动子。
还有,山羊和牛的相似性很高,可以参考牛的基因组序列,查到NCBI中有牛的mRNA序列,但是只有部分5’RACE序列,不到100bp的样子。。。因为目前山羊的基因组还没有公布,我们克隆山羊的启动子一般都是根据牛的基因组序列设计,不知道在有这些信息的情况下怎么设计引物克隆????求各位大神指教!!!
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niil

金虫 (正式写手)

克隆启动子的序列,用5‘ RACE是扩不出来的。
市面上有些genome walking的盒子,可以买着用用。如,宝生物的Genome Walking Kit,一千多块,10次,效果还可以的。
原理很简单,很容易上手,只是在根据CDS设计引物的时候避开外显子和内含子的边界区就可以了。
Stop fighting,let it flow.
10楼2013-06-26 15:40:08
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137167741

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
waterworld: 金币+3 2013-06-17 09:58:49
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-17 13:57:50
第一、可以在比对后在保守区设计引物来扩增
第二、步移
希望可以帮到你,试验顺利~~
总有一天我要修改用户名。
2楼2013-06-16 22:36:52
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hongyz

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
waterworld: 金币+3 2013-06-17 09:58:41
myprayer: Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-17 13:58:09
这篇文献应该可以解决你的问题: 长距离反向PCR技术高效扩增已知DNA片断的侧翼序列
3楼2013-06-17 00:16:26
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
waterworld: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-06-17 09:58:30
myprayer: Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-17 13:58:15
5’-RACE,基因组文库筛选出完整基因,反向PCR,染色体步移等。具体文献和Procotols,查分子克隆。

Molecular cloning--Laboratory manuals(2001)3rd edition(3 Volumes) Free
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5998393
4楼2013-06-17 01:27:49
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