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凌波丽

专家顾问 (知名作家)


kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-21 07:53:31
梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时,非特异性扩增较多,这时,最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环,退火温度降低1-2度,直至到达正常的Tm附近的退火温度。
21楼2013-07-20 14:02:26
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夏财神

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by windycui at 2013-07-20 10:25:26
楼主,其实PCR做不出有很多原因的,有时候可能不是你的反应体系或者反应条件的问题,有时可能真的是运气问题。我的建议是退火温度减5度,然后在正负2~3度之间做梯度,循环数增加到30个,然后两台PCR仪同时做一样的条 ...

恩,周一用不同的PCR仪也试试。退火温度是以Tm减5°C为中心吧?
谢谢:)
22楼2013-07-20 14:03:25
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夏财神

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by 孙启亮 at 2013-07-20 10:49:24
谢耳朵楼主:
      感觉最有可能就是引物问题,用引物blast验证一下吧

新入门做分子生物哈,我去学学引物Blast,谢谢提供建议
23楼2013-07-20 14:04:24
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夏财神

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
17楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-07-20 12:28:52
大概看了一下前面几楼的回复,其实应该基本都把问题点出来了,我就建议楼主注意几点:
1. 优化PCR条件,做温度梯度PCR,可以同时在不同的退火温度下反应,很容易学的。13楼说的很好,就在你认为最合适的Tm值上下2~ ...

好的,谢谢。这个太有帮助了,之前设计引物就没有考虑Blast,当然主要原因也是不会弄,我学习一下,再做做验证。
再次感谢:)
24楼2013-07-20 14:06:42
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夏财神

新虫 (小有名气)

引用回帖:
18楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-07-20 12:32:06
另外,若楼主问题解决了,希望能跟大家分享一下经验,多多交流~赠人玫瑰,手有余香!祝好!

好的,做出来之后一定分享经验。
25楼2013-07-20 14:07:22
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夏财神

新虫 (小有名气)

引用回帖:
19楼: Originally posted by hyphen007 at 2013-07-20 13:46:39
是什么带都没有吗?根据你的目的片段长度,会不会延伸时间过短?

上面也有同学给了类似意见,我试着调整一下。
神马条带也没有啊..
26楼2013-07-20 14:08:46
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
夏财神: 金币+2, 有帮助 2013-07-20 19:13:54
夏财神: 金币+5, ★★★很有帮助, 调整了引物浓度,非常有帮助!! 2013-07-22 21:47:50
你说一下你的加样量,各个成分
72°C 可以1.5min
修身、齐家、治国、平天下
27楼2013-07-20 18:48:42
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夏财神

新虫 (小有名气)

引用回帖:
27楼: Originally posted by alicelchf at 2013-07-20 18:48:42
你说一下你的加样量,各个成分
72°C 可以1.5min

我试一下1.5min,做的时候搞了四个目的片段,分别四600,1000,1200,1400~ 所以用了1min,下次我单独做做看,先p出一个再说。谢谢!
50uL体系:40 ddH2O;5uL 10X buffer;1uL Primer X 2; 1uL 模板;0.5 uL rTaq(Takara).
28楼2013-07-20 18:58:58
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alicelchf

木虫 (著名写手)

引用回帖:
28楼: Originally posted by 夏财神 at 2013-07-20 18:58:58
我试一下1.5min,做的时候搞了四个目的片段,分别四600,1000,1200,1400~ 所以用了1min,下次我单独做做看,先p出一个再说。谢谢!
50uL体系:40 ddH2O;5uL 10X buffer;1uL Primer X 2; 1uL 模板;0.5 uL rTaq( ...

如果你只需要先看看p出来没有,你可以25ul体系
另外,我不知道你的primer是多少的浓度,如果10um 你这个量是没有问题的
关键的还是反应各个时间和浓度 hehe

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

修身、齐家、治国、平天下
29楼2013-07-20 19:09:44
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夏财神

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
29楼: Originally posted by alicelchf at 2013-07-20 19:09:44
如果你只需要先看看p出来没有,你可以25ul体系
另外,我不知道你的primer是多少的浓度,如果10um 你这个量是没有问题的
关键的还是反应各个时间和浓度 hehe...

恩,我再算算各物质的浓度吧,谢谢
30楼2013-07-20 19:13:41
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