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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR扩增DNA序列无条带
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-21 07:53:31
梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
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21楼2013-07-20 14:02:26
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夏财神

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by windycui at 2013-07-20 10:25:26
楼主，其实PCR做不出有很多原因的，有时候可能不是你的反应体系或者反应条件的问题，有时可能真的是运气问题。我的建议是退火温度减5度，然后在正负2~3度之间做梯度，循环数增加到30个，然后两台PCR仪同时做一样的条 ...

恩，周一用不同的PCR仪也试试。退火温度是以Tm减5°C为中心吧？
谢谢：）
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22楼2013-07-20 14:03:25
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夏财神

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by 孙启亮 at 2013-07-20 10:49:24
谢耳朵楼主：
      感觉最有可能就是引物问题，用引物blast验证一下吧

新入门做分子生物哈，我去学学引物Blast，谢谢提供建议
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23楼2013-07-20 14:04:24
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夏财神

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
17楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-07-20 12:28:52
大概看了一下前面几楼的回复，其实应该基本都把问题点出来了，我就建议楼主注意几点：
1. 优化PCR条件，做温度梯度PCR，可以同时在不同的退火温度下反应，很容易学的。13楼说的很好，就在你认为最合适的Tm值上下2~ ...

好的，谢谢。这个太有帮助了，之前设计引物就没有考虑Blast，当然主要原因也是不会弄，我学习一下，再做做验证。
再次感谢：）
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24楼2013-07-20 14:06:42
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夏财神

新虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-07-20 12:32:06
另外，若楼主问题解决了，希望能跟大家分享一下经验，多多交流~赠人玫瑰，手有余香！祝好！

好的，做出来之后一定分享经验。
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25楼2013-07-20 14:07:22
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夏财神

新虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by hyphen007 at 2013-07-20 13:46:39
是什么带都没有吗？根据你的目的片段长度，会不会延伸时间过短？

上面也有同学给了类似意见，我试着调整一下。
神马条带也没有啊..
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26楼2013-07-20 14:08:46
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
夏财神: 金币+2, ★有帮助 2013-07-20 19:13:54
夏财神: 金币+5, ★★★很有帮助, 调整了引物浓度，非常有帮助！！ 2013-07-22 21:47:50
你说一下你的加样量，各个成分
72°C 可以1.5min
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修身、齐家、治国、平天下
27楼2013-07-20 18:48:42
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夏财神

新虫 (小有名气)
引用回帖:
27楼: Originally posted by alicelchf at 2013-07-20 18:48:42
你说一下你的加样量，各个成分
72°C 可以1.5min

我试一下1.5min，做的时候搞了四个目的片段，分别四600,1000,1200，1400~ 所以用了1min，下次我单独做做看，先p出一个再说。谢谢！
50uL体系：40 ddH2O；5uL 10X buffer；1uL Primer X 2; 1uL 模板；0.5 uL rTaq(Takara).
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28楼2013-07-20 18:58:58
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alicelchf

木虫 (著名写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by 夏财神 at 2013-07-20 18:58:58
我试一下1.5min，做的时候搞了四个目的片段，分别四600,1000,1200，1400~ 所以用了1min，下次我单独做做看，先p出一个再说。谢谢！
50uL体系：40 ddH2O；5uL 10X buffer；1uL Primer X 2; 1uL 模板；0.5 uL rTaq( ...

如果你只需要先看看p出来没有，你可以25ul体系
另外，我不知道你的primer是多少的浓度，如果10um 你这个量是没有问题的
关键的还是反应各个时间和浓度 hehe
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

夏财神
修身、齐家、治国、平天下
29楼2013-07-20 19:09:44
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夏财神

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
29楼: Originally posted by alicelchf at 2013-07-20 19:09:44
如果你只需要先看看p出来没有，你可以25ul体系
另外，我不知道你的primer是多少的浓度，如果10um 你这个量是没有问题的
关键的还是反应各个时间和浓度 hehe...

恩，我再算算各物质的浓度吧，谢谢
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30楼2013-07-20 19:13:41
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