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夏财神

新虫 (小有名气)

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[求助] PCR扩增DNA序列无条带

最近设计了几对引物分别扩增E. coli和P. aeruginosa的两个基因，但一直没有跑出条带，请高手们指点一下。

想要扩增的目的基因分别为1500 bp和1200 bp，在NCBI找到相应基因后，用MIT的Primer3设计了引物，Tm≈59，GC%在50~55%，引物长20 b。

PCR扩增条件：94°C 4 min；94°C 1 min；54°C 1 min；72°C 1 min；72°C 7 min。跑了27个循环。电泳之后没有条带。

考虑没有条带的原因可能是：模板、Taq酶、反应条件等，又做了下试验。
1、模板是基因组DNA，直接电泳后发现23 kb有明显条带，那应该模板没问题。
2、Taq酶是Takara的，前几天同学刚用过，按理说也没问题，而且我也重新做了实验，分别用Takara和Invitrogen的酶跑PCR，都没与条带。
3、引物可能设计的有问题，我用原来跑出过条带的16s引物做了对照，如果16s跑出来那肯定就是引物问题，但都没有条带就不好说了。但是这个条件16s也跑不出来了... 无法确诊
4、重新调整退火温度到56°C，同样无条带。

求诸位高手帮忙分析下，PCR失败的原因可能会什么啊？万分感谢！！

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王萌萌1992

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1楼2013-07-19 19:42:27

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lmcyjxs

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【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
夏财神: 金币+2, ★有帮助 2013-07-20 17:54:46
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-07-21 07:54:06
夏财神: 金币+15, ★★★很有帮助, 重新做了实验，温度没有问题，又核算了模板和引物的浓度，对后者进行了调整。然后将各种用量、时间根据说明书进行了调整，已经出了结果，太感谢了！ 2013-07-22 21:44:03

大概看了一下前面几楼的回复，其实应该基本都把问题点出来了，我就建议楼主注意几点：
1. 优化PCR条件，做温度梯度PCR，可以同时在不同的退火温度下反应，很容易学的。13楼说的很好，就在你认为最合适的Tm值上下2~3度作梯度，再稍宽一点也可以，看自己需要。另外，普遍经验是引物Tm值减5度就是你实际用于PCR的退火温度了；
2. 模板的量，按你说的，跑电泳后条带很清楚，估计你的模版含量应该是很丰富的，检查下是不是PCR体系中浓度太高了？另外，一定不要加错试剂。
3. 引物设计你觉得可能有问题，那么你就多设计几对试试，然后可用BLAST比对检查下引物的特异性。
4.你最终扩增的片段1000多bp，不长，应该不难扩才对，GC值也不算高，或者你可以用TAq酶说明书里的条件试试，只需将自己的退火问题改为自己的。另外，模板、引物、酶的量完全可以参考酶的说明书里的量试试看，一般不会有很大问题的。

祝好！