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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR扩增DNA序列无条带
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kzkz1015

金虫 (小有名气)
延伸时间延长到90s试一下,实在不行菌液PCR,再不行的话重新设计引物吧
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31楼2013-07-20 22:06:26
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夏财神

新虫 (小有名气)
引用回帖:
31楼: Originally posted by kzkz1015 at 2013-07-20 22:06:26
延伸时间延长到90s试一下,实在不行菌液PCR,再不行的话重新设计引物吧

恩，我试试看
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32楼2013-07-21 15:34:32
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夏财神

新虫 (小有名气)
引用回帖:
29楼: Originally posted by alicelchf at 2013-07-20 19:09:44
如果你只需要先看看p出来没有，你可以25ul体系
另外，我不知道你的primer是多少的浓度，如果10um 你这个量是没有问题的
关键的还是反应各个时间和浓度 hehe...

刚刚算了算，Primer的浓度时50uM，终浓度是1uM，正好处在takara那个酶说明书的上限，应该可以吧
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33楼2013-07-21 15:37:56
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alicelchf

木虫 (著名写手)
引用回帖:
33楼: Originally posted by 夏财神 at 2013-07-21 15:37:56
刚刚算了算，Primer的浓度时50uM，终浓度是1uM，正好处在takara那个酶说明书的上限，应该可以吧...

减少一下吧，50um的话，50ul体系加0.3的样子足已，太多是p不出的，只会小分子聚
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修身、齐家、治国、平天下
34楼2013-07-21 16:10:23
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bluecave

新虫 (初入文坛)
这种情况我也遇到过，如果没有别的失误，我估计你是酶用的不对，我曾经调一个2000bp左右的基因死活调不出来，最后用LA taq做出来了，虽然说普通的taq酶理论上能扩3k，但有时候事情就这么奇葩。你可以把pyrobest和LA都试试。
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35楼2013-07-22 14:16:43
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hyc_charles

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主，我可以告诉你一个秘密，其实你做了一段时间的PCR以后你会发现，有些模板和引物，不论你如何调整PCR条件，不论你如何更换试剂，你都无法P出你要的目的条带，或者时有时无。我不知道大家有没有这种感受，我曾经卡在这里2个月，试了所有办法，都没有用。最后把实验放了一段时间，再重新用同样的步骤去做，结果就出来了，我表示很无语……
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夏财神
不但要做一个优秀的人，更要做一个无可取代的人…
36楼2013-07-22 18:42:26
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夏财神

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
36楼: Originally posted by hyc_charles at 2013-07-22 18:42:26
楼主，我可以告诉你一个秘密，其实你做了一段时间的PCR以后你会发现，有些模板和引物，不论你如何调整PCR条件，不论你如何更换试剂，你都无法P出你要的目的条带，或者时有时无。我不知道大家有没有这种感受，我曾经 ...

前两天看到一句不错的话：Science is true; don't be misled by the facts.
共勉共勉。
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37楼2013-07-22 21:40:14
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夏财神

新虫 (小有名气)
引用回帖:
35楼: Originally posted by bluecave at 2013-07-22 14:16:43
这种情况我也遇到过，如果没有别的失误，我估计你是酶用的不对，我曾经调一个2000bp左右的基因死活调不出来，最后用LA taq做出来了，虽然说普通的taq酶理论上能扩3k，但有时候事情就这么奇葩。你可以把pyrobest和LA ...

已经做出来了，谢谢
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38楼2013-07-22 21:40:37
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夏财神

新虫 (小有名气)
夏财神: 回帖置顶 2013-07-22 22:00:10
多谢各位虫友的帮助，现在已经做出了初步结果。现在分享一下经验。

1、发现做不出条带之后，跟同学讨论了下，做了模板DNA的电泳，发现23K有条带，初步排除了DNA模板的问题。
2、根据虫友的意见，Blast了引物的特异性，并重新计算了引物的浓度，发现引物浓度略高，在体系中做了适当调整。
3、找到了Taq酶的说明书，重新校对了酶、缓冲溶液、dNTP、模板的终浓度要求（发现dNTP浓度低了）；同时根据说明书调整了PCR反应条件（变性和退火说明书要求30s即可，延伸时间调整到了1.5min），并根据虫友的意见进行了温度梯度PCR。

主要是做了上述工作，并对反应条件进行了调整。今天的实验结果目的基因条带比较清晰，多谢诸位虫友的帮忙！
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hyc_charles
39楼2013-07-22 21:59:28
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hyc_charles

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
39楼: Originally posted by 夏财神 at 2013-07-22 21:59:28
多谢各位虫友的帮助，现在已经做出了初步结果。现在分享一下经验。

1、发现做不出条带之后，跟同学讨论了下，做了模板DNA的电泳，发现23K有条带，初步排除了DNA模板的问题。
2、根据虫友的意见，Blast了引物的特 ...

赞赏和感谢楼主这一做法，记得在大家的帮助之后分享自己的心得，很多帖子一旦自己做出来了，就销声匿迹了，顶！！
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不但要做一个优秀的人，更要做一个无可取代的人…
40楼2013-07-23 10:34:50
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