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PCR扩增DNA序列无条带
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最近设计了几对引物分别扩增E. coli和P. aeruginosa的两个基因，但一直没有跑出条带，请高手们指点一下。 想要扩增的目的基因分别为1500 bp和1200 bp，在NCBI找到相应基因后，用MIT的Primer3设计了引物，Tm≈59，GC%在50~55%，引物长20 b。 PCR扩增条件：94°C 4 min；94°C 1 min；54°C 1 min；72°C 1 min；72°C 7 min。跑了27个循环。电泳之后没有条带。 考虑没有条带的原因可能是：模板、Taq酶、反应条件等，又做了下试验。 1、模板是基因组DNA，直接电泳后发现23 kb有明显条带，那应该模板没问题。 2、Taq酶是Takara的，前几天同学刚用过，按理说也没问题，而且我也重新做了实验，分别用Takara和Invitrogen的酶跑PCR，都没与条带。 3、引物可能设计的有问题，我用原来跑出过条带的16s引物做了对照，如果16s跑出来那肯定就是引物问题，但都没有条带就不好说了。但是这个条件16s也跑不出来了... 无法确诊 4、重新调整退火温度到56°C，同样无条带。 求诸位高手帮忙分析下，PCR失败的原因可能会什么啊？万分感谢！！ |
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夏财神: 回帖置顶 2013-07-22 22:00:10
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多谢各位虫友的帮助，现在已经做出了初步结果。现在分享一下经验。 1、发现做不出条带之后，跟同学讨论了下，做了模板DNA的电泳，发现23K有条带，初步排除了DNA模板的问题。 2、根据虫友的意见，Blast了引物的特异性，并重新计算了引物的浓度，发现引物浓度略高，在体系中做了适当调整。 3、找到了Taq酶的说明书，重新校对了酶、缓冲溶液、dNTP、模板的终浓度要求（发现dNTP浓度低了）；同时根据说明书调整了PCR反应条件（变性和退火说明书要求30s即可，延伸时间调整到了1.5min），并根据虫友的意见进行了温度梯度PCR。 主要是做了上述工作，并对反应条件进行了调整。今天的实验结果目的基因条带比较清晰，多谢诸位虫友的帮忙！ |
39楼2013-07-22 21:59:28
kapa1
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2楼2013-07-19 19:52:38
3楼2013-07-19 19:59:40
bullfrog325
木虫 (正式写手)
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4楼2013-07-19 20:40:00
