24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

夏财神

新虫 (小有名气)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 721.3
红花: 2
帖子: 58
在线: 154.7小时
虫号: 1776653
注册: 2012-04-24
性别: GG
专业: 环境微生物学

[求助] PCR扩增DNA序列无条带

最近设计了几对引物分别扩增E. coli和P. aeruginosa的两个基因，但一直没有跑出条带，请高手们指点一下。

想要扩增的目的基因分别为1500 bp和1200 bp，在NCBI找到相应基因后，用MIT的Primer3设计了引物，Tm≈59，GC%在50~55%，引物长20 b。

PCR扩增条件：94°C 4 min；94°C 1 min；54°C 1 min；72°C 1 min；72°C 7 min。跑了27个循环。电泳之后没有条带。

考虑没有条带的原因可能是：模板、Taq酶、反应条件等，又做了下试验。
1、模板是基因组DNA，直接电泳后发现23 kb有明显条带，那应该模板没问题。
2、Taq酶是Takara的，前几天同学刚用过，按理说也没问题，而且我也重新做了实验，分别用Takara和Invitrogen的酶跑PCR，都没与条带。
3、引物可能设计的有问题，我用原来跑出过条带的16s引物做了对照，如果16s跑出来那肯定就是引物问题，但都没有条带就不好说了。但是这个条件16s也跑不出来了... 无法确诊
4、重新调整退火温度到56°C，同样无条带。

求诸位高手帮忙分析下，PCR失败的原因可能会什么啊？万分感谢！！

回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

王萌萌1992

» 猜你喜欢

HILIC磁珠研究蛋白组学怎么做？已经有0人回复
His标签蛋白纯化怎么才能快？已经有0人回复
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费? 已经有75人回复
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析已经有0人回复
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用已经有0人回复
SHP2 变构抑制剂 Sitneprotafib：从作用机制到科研试剂选型要点已经有0人回复
PRMT5·MTA 抑制剂 MRTX1719 的科研应用已经有0人回复
SW033291 科研使用解析：分子特征、储存与实验获取要点已经有0人回复
泛 RAS 抑制新思路：大环肽拟似物如何同时牵住突变型与野生型 RAS？已经有0人回复
TYK2/JAK1 双靶点工具化合物 Brepocitinib：激酶选择性、研究进展与实验应用全解析已经有0人回复
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质控实录：从一张HPLC图谱读懂纯度与稳定性已经有0人回复

1楼 2013-07-19 19:42:27

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

夏财神

新虫 (小有名气)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 721.3
红花: 2
帖子: 58
在线: 154.7小时
虫号: 1776653
注册: 2012-04-24
性别: GG
专业: 环境微生物学

夏财神: 回帖置顶 2013-07-22 22:00:10

多谢各位虫友的帮助，现在已经做出了初步结果。现在分享一下经验。

1、发现做不出条带之后，跟同学讨论了下，做了模板DNA的电泳，发现23K有条带，初步排除了DNA模板的问题。
2、根据虫友的意见，Blast了引物的特异性，并重新计算了引物的浓度，发现引物浓度略高，在体系中做了适当调整。
3、找到了Taq酶的说明书，重新校对了酶、缓冲溶液、dNTP、模板的终浓度要求（发现dNTP浓度低了）；同时根据说明书调整了PCR反应条件（变性和退火说明书要求30s即可，延伸时间调整到了1.5min），并根据虫友的意见进行了温度梯度PCR。

主要是做了上述工作，并对反应条件进行了调整。今天的实验结果目的基因条带比较清晰，多谢诸位虫友的帮忙！