【答案】应助回帖

11楼2013-07-20 00:09:41

yilunanxia

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

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夏财神: 金币+5, ★★★很有帮助, 延长了时间，很有帮助 2013-07-22 21:46:03

72℃延伸步骤1min时间短了，takara的taq酶理论上最高一分钟延伸1k，你这目标条带这么长要么延长延伸时间，要么重新设计引物，把你的目标条带分两端扩增然后测序。
如果说内参有问题lz可以设计一个扩增内参只要内参扩增出来那么体系就没有问题。

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12楼2013-07-20 08:45:05

windycui

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夏财神: 金币+5, ★★★很有帮助, 学到了梯度PCR，和RP原因，谢谢，已经P出了目标条带 2013-07-22 21:46:47

楼主，其实PCR做不出有很多原因的，有时候可能不是你的反应体系或者反应条件的问题，有时可能真的是运气问题。我的建议是退火温度减5度，然后在正负2~3度之间做梯度，循环数增加到30个，然后两台PCR仪同时做一样的条件，有时候真的是不同PCR仪的结果不同，我们原来就有这样的情况，同一实验室两台同品牌同型号同期购买的PCR仪，就有一个P不出有一个能P出。当然只是建议，希望楼主尽快做出实验

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13楼2013-07-20 10:25:26

孙启亮

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【答案】应助回帖

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谢耳朵楼主：
感觉最有可能就是引物问题，用引物blast验证一下吧

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14楼2013-07-20 10:49:24

凌波丽

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引用回帖:

9楼: Originally posted by 夏财神 at 2013-07-20 00:04:09
谢谢，不过这个都太笼统了吧。
我前面给出了具体的条件和后续探索，希望这位高手能仔细看过之后再回答吧。

具体：
1、模板，前面提到是采用Omega的试剂盒提取，并经过电泳确认了，怎么再判断它是否有问题？
...

我说的还笼统！！！？？？

那我不说了！！！！

15楼2013-07-20 11:39:05

凌波丽

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好呀！！你有本事是吧！！！别问我呀！！！我讨厌你这样的人！！！

16楼2013-07-20 11:40:05

lmcyjxs

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夏财神: 金币+15, ★★★很有帮助, 重新做了实验，温度没有问题，又核算了模板和引物的浓度，对后者进行了调整。然后将各种用量、时间根据说明书进行了调整，已经出了结果，太感谢了！ 2013-07-22 21:44:03

大概看了一下前面几楼的回复，其实应该基本都把问题点出来了，我就建议楼主注意几点：
1. 优化PCR条件，做温度梯度PCR，可以同时在不同的退火温度下反应，很容易学的。13楼说的很好，就在你认为最合适的Tm值上下2~3度作梯度，再稍宽一点也可以，看自己需要。另外，普遍经验是引物Tm值减5度就是你实际用于PCR的退火温度了；
2. 模板的量，按你说的，跑电泳后条带很清楚，估计你的模版含量应该是很丰富的，检查下是不是PCR体系中浓度太高了？另外，一定不要加错试剂。
3. 引物设计你觉得可能有问题，那么你就多设计几对试试，然后可用BLAST比对检查下引物的特异性。
4.你最终扩增的片段1000多bp，不长，应该不难扩才对，GC值也不算高，或者你可以用TAq酶说明书里的条件试试，只需将自己的退火问题改为自己的。另外，模板、引物、酶的量完全可以参考酶的说明书里的量试试看，一般不会有很大问题的。

祝好！

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思路决定出路。。。

17楼2013-07-20 12:28:52

lmcyjxs

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另外，若楼主问题解决了，希望能跟大家分享一下经验，多多交流~赠人玫瑰，手有余香！祝好！

思路决定出路。。。

18楼2013-07-20 12:32:06

hyphen007

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是什么带都没有吗？根据你的目的片段长度，会不会延伸时间过短？

19楼2013-07-20 13:46:39

夏财神

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引用回帖:

12楼: Originally posted by yilunanxia at 2013-07-20 08:45:05
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如果说内参有问题lz可以设计一个扩增内参只要内参 ...

谢谢，我试一下调整延伸的时间。

20楼2013-07-20 14:02:19