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夏财神

新虫 (小有名气)

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[求助] PCR扩增DNA序列无条带

最近设计了几对引物分别扩增E. coli和P. aeruginosa的两个基因，但一直没有跑出条带，请高手们指点一下。

想要扩增的目的基因分别为1500 bp和1200 bp，在NCBI找到相应基因后，用MIT的Primer3设计了引物，Tm≈59，GC%在50~55%，引物长20 b。

PCR扩增条件：94°C 4 min；94°C 1 min；54°C 1 min；72°C 1 min；72°C 7 min。跑了27个循环。电泳之后没有条带。

考虑没有条带的原因可能是：模板、Taq酶、反应条件等，又做了下试验。
1、模板是基因组DNA，直接电泳后发现23 kb有明显条带，那应该模板没问题。
2、Taq酶是Takara的，前几天同学刚用过，按理说也没问题，而且我也重新做了实验，分别用Takara和Invitrogen的酶跑PCR，都没与条带。
3、引物可能设计的有问题，我用原来跑出过条带的16s引物做了对照，如果16s跑出来那肯定就是引物问题，但都没有条带就不好说了。但是这个条件16s也跑不出来了... 无法确诊
4、重新调整退火温度到56°C，同样无条带。

求诸位高手帮忙分析下，PCR失败的原因可能会什么啊？万分感谢！！

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王萌萌1992

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1楼2013-07-19 19:42:27

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windycui

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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夏财神: 金币+2, ★有帮助 2013-07-20 17:54:03
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-21 07:53:49
夏财神: 金币+5, ★★★很有帮助, 学到了梯度PCR，和RP原因，谢谢，已经P出了目标条带 2013-07-22 21:46:47

楼主，其实PCR做不出有很多原因的，有时候可能不是你的反应体系或者反应条件的问题，有时可能真的是运气问题。我的建议是退火温度减5度，然后在正负2~3度之间做梯度，循环数增加到30个，然后两台PCR仪同时做一样的条件，有时候真的是不同PCR仪的结果不同，我们原来就有这样的情况，同一实验室两台同品牌同型号同期购买的PCR仪，就有一个P不出有一个能P出。当然只是建议，希望楼主尽快做出实验