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各位做qPCR的大侠看过来～～～～～～
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请问各位大侠， 1.qPCR 退火温度与PCR退火温度之间有什么关系呢？有人说同一引物qPCR的退火温度大概比PCR退火温度高5度左右，这个说法有什么依据嘛？ 2.如果两者木有关系，那么对于全新的qPCR引物，如何确定其最佳退火温度呢？ 拜托给我一个回答吧～～～～～～谢谢大家～～～～～～～～～～～～ |
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| 一般做个退火温度梯度寻找最佳退火温度。可以在已知普通PCR的退火温度基础上做，也可以根据理论Tm做。 |
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一般做RT-qPCR所设计的引物的退火温度在60度以上为宜。 接下来把你要分析的所有基因，还有内参都做一下梯度，根据CT值和扩增效率选最高可用的退火温度。 |
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6楼2012-10-05 08:20:06
7楼2012-10-05 16:00:02
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CT值是产物浓度达到阈值时候的循环数。在线性扩增范围内，扩增效率应该是接近100%的。如果扩增效率超过100%可能是有引物二聚体形成或者非特异性扩增。 |
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