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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 各位做qPCR的大侠看过来～～～～～～
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lenalee119

铜虫 (初入文坛)

[求助] 各位做qPCR的大侠看过来～～～～～～

请问各位大侠，
1.qPCR 退火温度与PCR退火温度之间有什么关系呢？有人说同一引物qPCR的退火温度大概比PCR退火温度高5度左右，这个说法有什么依据嘛？
2.如果两者木有关系，那么对于全新的qPCR引物，如何确定其最佳退火温度呢？

拜托给我一个回答吧～～～～～～谢谢大家～～～～～～～～～～～～
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lenalee119

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1楼 2012-10-03 20:43:39
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lenalee119: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-10-04 15:54:35
当然有关系啊，虽然二者的BUFFER不一样，但是可以通过普通PCR确定引物的大体退火温度，然后再在这个温度左右几度来做QPCR来确定最佳QPCR退火温度，如果上来就用QPCR摸索条件岂不是浪费嘛
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2楼2012-10-04 07:56:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lenalee119: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-10-04 15:54:48
一般做个退火温度梯度寻找最佳退火温度。可以在已知普通PCR的退火温度基础上做，也可以根据理论Tm做。
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lenalee119
3楼2012-10-04 08:46:58
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lenalee119

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
谢谢回答！
我还想问一下，PCR退火温度好不好可以通过电泳的条带看出来，那么qPCR的退火温度好不好怎么判断呢？
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4楼2012-10-04 15:48:37
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lenalee119

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-04 08:46:58
一般做个退火温度梯度寻找最佳退火温度。可以在已知普通PCR的退火温度基础上做，也可以根据理论Tm做。

谢谢回答！
我现在已经做了退火温度梯度找出了普通PCR的最佳退火温度（比如说是48度），请问接下来的qPCR温度怎么设定比较好呢？可以帮我说的详细一些嘛？
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5楼2012-10-04 15:53:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
lenalee119: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-10-05 16:00:17
引用回帖:
5楼: Originally posted by lenalee119 at 2012-10-04 15:53:25
谢谢回答！
我现在已经做了退火温度梯度找出了普通PCR的最佳退火温度（比如说是48度），请问接下来的qPCR温度怎么设定比较好呢？可以帮我说的详细一些嘛？...

一般做RT-qPCR所设计的引物的退火温度在60度以上为宜。
接下来把你要分析的所有基因，还有内参都做一下梯度，根据CT值和扩增效率选最高可用的退火温度。
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lenalee119
6楼2012-10-05 08:20:06
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lenalee119

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-05 08:20:06
一般做RT-qPCR所设计的引物的退火温度在60度以上为宜。
接下来把你要分析的所有基因，还有内参都做一下梯度，根据CT值和扩增效率选最高可用的退火温度。...

谢谢！
不好意思我是新手想再问一下：
1, 怎么通过CT值判断呀？也是越高越好嘛？
2, 我有时候根据公式算出来扩增效率超过100％了，这正常嘛？

先把剩下的金币都给你了，麻烦您不厌其烦稍微帮我讲一下吧～
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7楼2012-10-05 16:00:02
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lenalee119 at 2012-10-05 16:00:02
谢谢！
不好意思我是新手想再问一下：
1, 怎么通过CT值判断呀？也是越高越好嘛？
2, 我有时候根据公式算出来扩增效率超过100％了，这正常嘛？

先把剩下的金币都给你了，麻烦您不厌其烦稍微帮我讲一下吧～...

CT值是产物浓度达到阈值时候的循环数。在线性扩增范围内，扩增效率应该是接近100%的。如果扩增效率超过100%可能是有引物二聚体形成或者非特异性扩增。
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lenalee119
8楼2012-10-06 08:20:52
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lenalee119

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-06 08:20:52
CT值是产物浓度达到阈值时候的循环数。在线性扩增范围内，扩增效率应该是接近100%的。如果扩增效率超过100%可能是有引物二聚体形成或者非特异性扩增。...

原来如此！我再研究一下！
多谢！
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9楼2012-10-15 16:42:16
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