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lenalee119

铜虫 (初入文坛)

[求助] 各位做qPCR的大侠看过来~~~~~~

请问各位大侠,
1.qPCR 退火温度与PCR退火温度之间有什么关系呢?有人说同一引物qPCR的退火温度大概比PCR退火温度高5度左右,这个说法有什么依据嘛?
2.如果两者木有关系,那么对于全新的qPCR引物,如何确定其最佳退火温度呢?

拜托给我一个回答吧~~~~~~谢谢大家~~~~~~~~~~~~
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lenalee119

铜虫 (初入文坛)

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引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-06 08:20:52
CT值是产物浓度达到阈值时候的循环数。在线性扩增范围内,扩增效率应该是接近100%的。如果扩增效率超过100%可能是有引物二聚体形成或者非特异性扩增。...

原来如此!我再研究一下!
多谢!
9楼2012-10-15 16:42:16
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lenalee119: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-10-04 15:54:35
当然有关系啊,虽然二者的BUFFER不一样,但是可以通过普通PCR确定引物的大体退火温度,然后再在这个温度左右几度来做QPCR来确定最佳QPCR退火温度,如果上来就用QPCR摸索条件岂不是浪费嘛
2楼2012-10-04 07:56:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lenalee119: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-10-04 15:54:48
一般做个退火温度梯度寻找最佳退火温度。可以在已知普通PCR的退火温度基础上做,也可以根据理论Tm做。

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3楼2012-10-04 08:46:58
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lenalee119

铜虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
谢谢回答!
我还想问一下,PCR退火温度好不好可以通过电泳的条带看出来,那么qPCR的退火温度好不好怎么判断呢?
4楼2012-10-04 15:48:37
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