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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR出现非特异性扩增，求高手解答
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知音者2

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR出现非特异性扩增，求高手解答

体系：2xmix 12.5ul,引物（Im26-f,Im3r）各0.5ul，ddw10.5，模版200ng，1ul。程序94 5min，94 30s，56 30s，72 60s，72 7min，30个循环。出现非特异性扩增，求高手解答
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1楼 2012-08-25 10:26:03
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wcwluwei

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
2楼2012-08-25 11:47:03
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-25 20:12:08
楼主，需要把你的PCR具体信息给出才好分析，例如，引物浓度，你的引物是如何设计的，目标片段是多少等等，其次，你的PCR目的是什么，如果是为了做QPCR，非特异带是绝对不允许的，如果只是做MAKRE倒是关系不大，如果是克隆基因或做表达，只克隆目标就可以了，请说明你的意图。
其次，可以提高退火温度，降低镁离子浓度，加入适量DMSO提高特异性。
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3楼2012-08-25 15:01:50
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知音者2

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-25 15:01:50
楼主，需要把你的PCR具体信息给出才好分析，例如，引物浓度，你的引物是如何设计的，目标片段是多少等等，其次，你的PCR目的是什么，如果是为了做QPCR，非特异带是绝对不允许的，如果只是做MAKRE倒是关系不大，如果 ...

非常感谢，引物浓度是10um，是参考外文文献设计的，目标片段是1400kb。我要做nested-pcr。
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4楼2012-08-25 16:48:41
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生物-TJAB

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以提高退火温度，或加入DMSO！最好两个同时优化一下！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2012-08-26 00:00:15
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这么少的信息，相信没人能给你一个准确的分析结果。其他都没问题的话，单纯提高特异性，可以提高退火温度，或加DMSO。
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6楼2012-08-26 13:13:50
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xiayongxiu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，很热心哈 2012-08-27 13:42:37
首先，确定你的非特异性带是怎么来的，也就是简单地做一个无模板对照，一般做PCR最后做一个阴性对照和阳性对照，看你的操作是否有误或者试剂有无污染之类的，如果是你比较成熟的体系，可以不做对照，但是如果是刚开始一个新的程序，最好还是做个阴性对照，排除是水或者试剂的污染造成的非特性带，然后才是看是否由于退火温度引起的。一般情况下PCR的退火温度要根据你的引物Tm值来确定，一般是比引物Tm值低3度左右，当然有的高保真酶是要求比引物Tm值高；有非特异性条带的另一种可能是你设计的引物刚好在基因组其他地方也能扩增，也就是引物的特异性不是很好，你设计好引物后，可以先Blast一下。希望能帮助你。
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一切都要靠自己努力
7楼2012-08-26 19:20:51
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-08-27 13:42:48
1：楼主信息给的不全，你要扩的目的条带是多少
2：特异性不好原因有很多，镁离子浓度，退火温度，延伸时间都可能影响，建议楼主根据引物合成单上的TM值在±5℃的范围内进行温度梯度PCR，挑选合适退火温度后再优化引物浓度，镁离子浓度，模板浓度等条件，如果是做克隆，目的片段GC含量较高可以考虑换用专用的酶.
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
8楼2012-08-27 08:44:43
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
采用touchdownPCR就可以去除非特异性条带了
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生物化学与分子生物学
9楼2012-08-27 10:13:37
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1400bp的话你的延伸时间好像不够长啊，你用的事什么酶?当然主要还是引物的问题
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10楼2012-08-27 11:16:18
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