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知音者2

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR出现非特异性扩增，求高手解答

体系：2xmix 12.5ul,引物（Im26-f,Im3r）各0.5ul，ddw10.5，模版200ng，1ul。程序94 5min，94 30s，56 30s，72 60s，72 7min，30个循环。出现非特异性扩增，求高手解答
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1楼 2012-08-25 10:26:03
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-08-27 13:42:48
1：楼主信息给的不全，你要扩的目的条带是多少
2：特异性不好原因有很多，镁离子浓度，退火温度，延伸时间都可能影响，建议楼主根据引物合成单上的TM值在±5℃的范围内进行温度梯度PCR，挑选合适退火温度后再优化引物浓度，镁离子浓度，模板浓度等条件，如果是做克隆，目的片段GC含量较高可以考虑换用专用的酶.
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
8楼2012-08-27 08:44:43
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wcwluwei

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
2楼2012-08-25 11:47:03
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-25 20:12:08
楼主，需要把你的PCR具体信息给出才好分析，例如，引物浓度，你的引物是如何设计的，目标片段是多少等等，其次，你的PCR目的是什么，如果是为了做QPCR，非特异带是绝对不允许的，如果只是做MAKRE倒是关系不大，如果是克隆基因或做表达，只克隆目标就可以了，请说明你的意图。
其次，可以提高退火温度，降低镁离子浓度，加入适量DMSO提高特异性。
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3楼2012-08-25 15:01:50
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知音者2

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-25 15:01:50
楼主，需要把你的PCR具体信息给出才好分析，例如，引物浓度，你的引物是如何设计的，目标片段是多少等等，其次，你的PCR目的是什么，如果是为了做QPCR，非特异带是绝对不允许的，如果只是做MAKRE倒是关系不大，如果 ...

非常感谢，引物浓度是10um，是参考外文文献设计的，目标片段是1400kb。我要做nested-pcr。
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4楼2012-08-25 16:48:41
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