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shiliyusly新虫 (小有名气)
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QPCR之 扩增效率
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大家好，做实时定量PCR以前都是用Thermo的试剂盒最近改用promega的，同个基因相同的退火温度，溶解曲线却不同，如下图，promega的溶解曲线圈出部分荧光强度为负值，这样正常吗？应该如何改进呢？？谢谢 promega.jpg  thermo.jpg |
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| 溶解曲线主要是看有没有非特异的峰，用来判断引物扩增的特异性的，开始几个温度内荧光呈现负值属正常现象，这可能是仪器本身的原因，你的溶解曲线很好，不用做改进了。 |
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shiliyusly
2楼2013-04-04 21:16:36
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| 不知道你的引物的退火温度是多少。在温度较低的情况下，可能是引物与模板发生了anealing，造成双链DNA增加，所以荧光增加，对于熔接曲线来说会产生一点负值区域也属于正常的。一般这种情况下，可以把做熔接曲线的起始温度稍微提高一些，一般是Tm+5°C开始就可以了。不同的盒子这方面不太一样也是可能的。熔接曲线主要看产物是否单一，我觉得你的这个熔接曲线还是不错的。至于扩增效率问题，需要做标准曲线。不到90%是有些低，你是否优化了退火温度？ |
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5楼2013-04-05 00:07:07
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退火温度为58度，我把5倍浓度的模板进行5倍稀释度稀释成5个浓度梯度做的扩增效率曲线，扩增效率只有70%左右，然后我把退火温度降了2度，可是扩增效率差不多。溶解曲线的温度就是仪器给出的95度30秒，60度1分钟，95度15秒，60度15秒，以前用thermo试剂盒都是这样的程序，从没出现过这么大范围的负值。7楼2013-04-05 10:42:25
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