| 查看: 2807 | 回复: 8 | ||||
shiliyusly新虫 (小有名气)
|
[求助]
QPCR之 扩增效率
|
大家好，做实时定量PCR以前都是用Thermo的试剂盒最近改用promega的，同个基因相同的退火温度，溶解曲线却不同，如下图，promega的溶解曲线圈出部分荧光强度为负值，这样正常吗？应该如何改进呢？？谢谢 promega.jpg  thermo.jpg |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 | 实验方法 |
» 本帖@通知
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有80人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- QPCR扩增效率太低
已经有20人回复
- QPCR之 扩增效率
已经有8人回复
- 荧光定量PCR扩增效率低
已经有16人回复
- QPCR 溶解曲线
已经有9人回复
- qPCR的标准曲线成线性很差，扩增效率低，是什么原因
已经有6人回复
- 求高人指点qpcr问题，扩增效率太高！
已经有14人回复
- qPCR总出现非特异性扩增，到底是怎么回事？
已经有19人回复
- 相对定量中怎样提高扩增效率
已经有5人回复
- real-time PCR相对定量2 -△△CT法中用来判断扩增效率的标准曲线怎么制作？
已经有8人回复
- 基因引物与内参引物
已经有14人回复
- 各位做qPCR的大侠看过来～～～～～～
已经有8人回复
- Realtime PCR 内参与目的基因问题
已经有11人回复
- 荧光定量pcr溶解曲线好几个峰，但是电泳只有一条目的条带，怎么回事
已经有5人回复
- RT-qPCR实验问题
已经有23人回复
- 大家做RT-qPCR设计引物用的什么软件呀？
已经有15人回复
- 着急！RT-PCR扩增效率低，情况很诡异，求助高手帮忙指点
已经有12人回复
- 关于qPCR的几个问题，求解答
已经有3人回复
- 一个关于qPCR标准曲线的问题。谢谢！
已经有12人回复
- 荧光定量PCR扩增效率怎么做？？？？我要被逼疯了
已经有17人回复
- 荧光定量扩增效率低怎么办
已经有3人回复
- 帮我看看这个溶解qPCR曲线
已经有6人回复
gyesang
荣誉版主 (著名写手)
-
专家经验: +24 - MolEPI: 31
- 应助: 599 (博士)
- 贵宾: 2.689
- 金币: 24334.9
- 散金: 1088
- 红花: 88
- 沙发: 2
- 帖子: 2327
- 在线: 623.1小时
- 虫号: 849017
- 注册: 2009-09-16
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
- 管辖: 分子生物
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+3, ★有帮助 2013-04-04 22:00:03
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+3, ★有帮助 2013-04-04 22:00:03
| 溶解曲线主要是看有没有非特异的峰，用来判断引物扩增的特异性的，开始几个温度内荧光呈现负值属正常现象，这可能是仪器本身的原因，你的溶解曲线很好，不用做改进了。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
shiliyusly
2楼2013-04-04 21:16:36
shiliyusly
新虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 265.4
- 散金: 17
- 红花: 1
- 帖子: 138
- 在线: 71.5小时
- 虫号: 1434769
- 注册: 2011-10-10
- 专业: 食品科学基础
3楼2013-04-04 21:59:54
gyesang
荣誉版主 (著名写手)
-
专家经验: +24 - MolEPI: 31
- 应助: 599 (博士)
- 贵宾: 2.689
- 金币: 24334.9
- 散金: 1088
- 红花: 88
- 沙发: 2
- 帖子: 2327
- 在线: 623.1小时
- 虫号: 849017
- 注册: 2009-09-16
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
- 管辖: 分子生物
4楼2013-04-04 23:14:01
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+3 2013-04-05 10:42:30
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-04-05 13:19:52
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+3 2013-04-05 10:42:30
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-04-05 13:19:52
| 不知道你的引物的退火温度是多少。在温度较低的情况下，可能是引物与模板发生了anealing，造成双链DNA增加，所以荧光增加，对于熔接曲线来说会产生一点负值区域也属于正常的。一般这种情况下，可以把做熔接曲线的起始温度稍微提高一些，一般是Tm+5°C开始就可以了。不同的盒子这方面不太一样也是可能的。熔接曲线主要看产物是否单一，我觉得你的这个熔接曲线还是不错的。至于扩增效率问题，需要做标准曲线。不到90%是有些低，你是否优化了退火温度？ |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
5楼2013-04-05 00:07:07
shiliyusly
新虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 265.4
- 散金: 17
- 红花: 1
- 帖子: 138
- 在线: 71.5小时
- 虫号: 1434769
- 注册: 2011-10-10
- 专业: 食品科学基础
6楼2013-04-05 10:36:18
shiliyusly
新虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 265.4
- 散金: 17
- 红花: 1
- 帖子: 138
- 在线: 71.5小时
- 虫号: 1434769
- 注册: 2011-10-10
- 专业: 食品科学基础
退火温度为58度，我把5倍浓度的模板进行5倍稀释度稀释成5个浓度梯度做的扩增效率曲线，扩增效率只有70%左右，然后我把退火温度降了2度，可是扩增效率差不多。溶解曲线的温度就是仪器给出的95度30秒，60度1分钟，95度15秒，60度15秒，以前用thermo试剂盒都是这样的程序，从没出现过这么大范围的负值。 7楼2013-04-05 10:42:25
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
8楼2013-04-05 23:50:00
shiliyusly
新虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 265.4
- 散金: 17
- 红花: 1
- 帖子: 138
- 在线: 71.5小时
- 虫号: 1434769
- 注册: 2011-10-10
- 专业: 食品科学基础
9楼2013-04-06 10:01:11
