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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » QPCR之 扩增效率
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] QPCR之 扩增效率

大家好，做实时定量PCR以前都是用Thermo的试剂盒最近改用promega的，同个基因相同的退火温度，溶解曲线却不同，如下图，promega的溶解曲线圈出部分荧光强度为负值，这样正常吗？应该如何改进呢？？谢谢

promega.jpg



thermo.jpg
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1楼2013-04-04 20:31:34
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
shiliyusly: 金币+2 2013-04-06 10:01:19
做标准曲线时CT值最好在20-30之间。做标准曲线之前最好做一个退火温度梯度。一般情况下引物在一个温度较广的范围都能有不错的扩增，你需要在不影响扩增的前提下尽量选取高的退火温度。溶解曲线一般是在选定的退火温度+5开始到95，0.5°C/step，10s。
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8楼2013-04-05 23:50:00
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+3, ★有帮助 2013-04-04 22:00:03
溶解曲线主要是看有没有非特异的峰，用来判断引物扩增的特异性的，开始几个温度内荧光呈现负值属正常现象，这可能是仪器本身的原因，你的溶解曲线很好，不用做改进了。
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shiliyusly
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-04-04 21:16:36
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-04 21:16:36
溶解曲线主要是看有没有非特异的峰，用来判断引物扩增的特异性的，开始几个温度内荧光呈现负值属正常现象，这可能是仪器本身的原因，你的溶解曲线很好，不用做改进了。

谢谢你！但是我用的是同一台仪器，只是试剂盒不一样，其他的模板基因等条件都是一样的，溶解曲线却是差别这么大，上面的第一副图圈出那么大部分都是复制，第个溶解曲线只有刚开始的部分是负值，扩增效率也不是很高，90%不到呢
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3楼2013-04-04 21:59:54
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gyesang

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优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-04-04 21:59:54
谢谢你！但是我用的是同一台仪器，只是试剂盒不一样，其他的模板基因等条件都是一样的，溶解曲线却是差别这么大，上面的第一副图圈出那么大部分都是复制，第个溶解曲线只有刚开始的部分是负值，扩增效率也不是很高 ...

主要看峰是否在同一位置即可，溶解曲线看不出扩增效率，扩增效率要做标准曲线
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-04-04 23:14:01
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