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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » QPCR之 扩增效率
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] QPCR之 扩增效率

大家好，做实时定量PCR以前都是用Thermo的试剂盒最近改用promega的，同个基因相同的退火温度，溶解曲线却不同，如下图，promega的溶解曲线圈出部分荧光强度为负值，这样正常吗？应该如何改进呢？？谢谢

promega.jpg



thermo.jpg
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1楼2013-04-04 20:31:34
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
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2楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-04 21:16:36
溶解曲线主要是看有没有非特异的峰，用来判断引物扩增的特异性的，开始几个温度内荧光呈现负值属正常现象，这可能是仪器本身的原因，你的溶解曲线很好，不用做改进了。

谢谢你！但是我用的是同一台仪器，只是试剂盒不一样，其他的模板基因等条件都是一样的，溶解曲线却是差别这么大，上面的第一副图圈出那么大部分都是复制，第个溶解曲线只有刚开始的部分是负值，扩增效率也不是很高，90%不到呢
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3楼2013-04-04 21:59:54
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-04 23:14:01
主要看峰是否在同一位置即可，溶解曲线看不出扩增效率，扩增效率要做标准曲线...

扩增效率我是另外做的，有点低。从上面2个图看出两个峰的位置好像相差2度呢
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6楼2013-04-05 10:36:18
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
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5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-05 00:07:07
不知道你的引物的退火温度是多少。在温度较低的情况下，可能是引物与模板发生了anealing，造成双链DNA增加，所以荧光增加，对于熔接曲线来说会产生一点负值区域也属于正常的。一般这种情况下，可以把做熔接曲线的起 ...

退火温度为58度，我把5倍浓度的模板进行5倍稀释度稀释成5个浓度梯度做的扩增效率曲线，扩增效率只有70%左右，然后我把退火温度降了2度，可是扩增效率差不多。溶解曲线的温度就是仪器给出的95度30秒，60度1分钟，95度15秒，60度15秒，以前用thermo试剂盒都是这样的程序，从没出现过这么大范围的负值。
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7楼2013-04-05 10:42:25
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-05 23:50:00
做标准曲线时CT值最好在20-30之间。做标准曲线之前最好做一个退火温度梯度。一般情况下引物在一个温度较广的范围都能有不错的扩增，你需要在不影响扩增的前提下尽量选取高的退火温度。溶解曲线一般是在选定的退火温 ...

嗯，我那个溶解曲线的温度程序是仪器给出的，看他的图好像和你说的差不多哦。
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9楼2013-04-06 10:01:11
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